隨著我國工業化進程的不斷加快，工業廢水排放量也日益激增，其對水環境的影響程度已不容忽視。特別是高濃度氨氮廢水的超標排放，極易造成自然水體富營養化，出現水華和赤潮現象。生化處理是現今應用最廣、最經濟的污水處理方式，常見工藝包括以活性污泥法為基礎的AO，A2/O和MBR等。活性污泥內部微生物在代謝分解污染物時，一方面將污染物中的碳氮物質用于自身生長，另一方面，與其他生物共同組成較為穩定的微生態系統。因此，活性污泥中微生物多樣性的研究對優化處理工藝具有重要意義。
然而，由于傳統分子生物學技術的限制，分離培養法只能鑒別不足1%的微生物，難以揭示活性污泥中微生物的群落結構和生長機制。近年來，隨著分子生物學技術的發展，具有通量高、成本低、靈敏度高、流程自動化等優勢的高通量測序技術已廣泛應用于污泥微生物的研究，并且在揭示水處理工藝功能菌群方面發揮了重要作用。AO工藝作為重要的活性污泥法工藝之一，具有耗能低、脫氮效果良好、抗沖擊負荷能力強等優點，其微生物群落結構動態主要受溫度和進水水質等影響。孫豆豆通過對比5 ℃及10 ℃下AO工藝中的活性污泥，發現各微生物樣品門、綱水平上差異較小，主要綱均為鞘脂桿菌綱和Betaproteobacteria綱，而嗜熱絲菌門和脫鐵桿菌門等只在5 ℃的樣品中發現。蒙小俊等研究發現，AO工藝處理焦化廢水時，其處理效果穩定期好氧段中優勢菌門主要為Proteobacteria、Planctomycetes、Acidobacteria、Candidatus、Saccharibacteria和Bacteroidetes等，并且Proteobacteria門占主導地位，其相對豐度比例為36.00%~76.98%。鄒曉鳳等發現在AO工藝處理煤化工廢水時，好氧段中微生物的主要菌屬為未分類菌屬、Nitrospira、Nitrosospira、Azospira、Coxiella和Vampirovibrio等。
此外，在淀粉廢水中，氨氮含量較高，碳氮比難以滿足微生物正常代謝分解。利用AO工藝解讀淀粉廠廢水處理效能及微生物群落結構的研究，以及結合實際污水廠及實驗室小試裝置解讀其運行過程中微生物差異性的研究均鮮有報道�；诖�，本研究以河北某淀粉工業污水處理廠及實驗室AO反應器為研究對象，通過調試AO工藝的運行參數優化水質處理效果;同時利用Miseq測序技術，解析污水廠及實驗室AO反應器各階段微生物群落動態變化;結合ANOVA分析方法，解讀污水廠及實驗室AO反應器微生物群落結構差異，為淀粉工業廢水處理工藝的穩定運行提供技術支撐與理論依據。
1 材料與方法
1.1 污水站及反應器運行
污泥樣品取自河北省某淀粉工業污水處理廠，該廠設計水量15 000 m3·d−1，進水主要有3個來源：淀粉廠區廢水、維生素B12廠區廢水和企業內部生活污水。其中淀粉園區廢水量9 948 m3·d−1，維生素B12廢水量5 956 m3·d−1。該站主體工藝為多組改良型AO工藝，進水COD和NH4+-N平均濃度分別為500 mg·L−1和450 mg·L−1。污水站主要設計運行參數：污泥濃度3 000 mg·L−1，混合液回流比50%，污泥回流比50%。共監測水質142 d，其中第1～60天為前期調試階段，第61～142天為后期穩定運行階段。分別于污水廠調試開始時及氨氮去除率穩定在98%時，即第3天取污泥樣品，編號為X1(缺氧段)和X2(好氧段)，第132天取污泥樣品編號為Z1(缺氧段)和Z2(好氧段)。取樣置于冰桶中運回實驗室，離心(5 min，11 000 r·min−1)后稱取5 g冷凍于−80 ℃冰箱中，以備DNA提取。
AO反應器如圖1所示，其采用有機玻璃制作，主體由進水桶(50 L)，缺氧池(A池，1.8 L)，好氧池(O池，5.4 L)以及沉淀池和蠕動泵組成。接種污泥取自淀粉工業污水處理廠生化池，接種污泥濃度(MLSS)為3 000 mg·L−1左右。污水廠污泥取回后，悶曝24 h后排出上清液，去除原有污水中的有機成分，在AO工藝溶液體積不變的情況下緩慢進人工配水。為保證實驗室AO裝置與污水廠可比性，進水COD和氨氮平均濃度分別為500 mg·L−1和450 mg·L−1，人工配水組成：葡萄糖680 mg·L−1，氯化銨440 mg·L−1，磷酸二氫鉀100 mg·L−1，七水合硫酸鎂100 mg·L−1，七水合硫酸鋅0.06 mg·L−1，氯化鈣47 mg·L−1，硫酸亞鐵40 mg·L−1，硫酸鎂40 mg·L−1，并且需添加微量 CoCl2·6H2O和(NH4)6Mo7O24·4H2O，以保證微生物生長所必需的微量元素[11]。
AO工藝進水及污泥回流均采用蠕動泵控制流量，進水流量初期控制為0.1 L·h−1，因裝置反應體積較小，蠕動泵污泥及硝化液回流量較低，故適當提高回流比，使污泥和硝化液回流比分別為200%和100%，初期缺氧段和好氧段溶解氧濃度分別為0.1 mg·L−1和6.5 mg·L−1。水質監測共45 d。在實際監測過程中，根據COD濃度變化投加碳源，在污泥馴化過程中及AO反應器脫氮效率穩定在85%時，水質不再發生明顯變化，分別在第5天、第20天、第41天取污泥樣品150 mL，根據時間先后順序編號W1、W2、W3，離心(5 min，11 000 r·min−1)后稱取5 g冷凍于−80 ℃冰箱中，以備DNA提取。
圖1 實驗室AO反應器流程圖
1.2 DNA提取及PCR擴增
DNA提取采用PowerSoil® DNA Isolation Kit試劑盒，按照試劑盒流程提取DNA。以所提取各樣品DNA為模版，對其16S rDNA V4區擴增。反應體系為30 μL，上游引物為EUb341f：5′-cctacgggaggcagcag-3′，下游引物為Eub907r：5′-ccgtcaattcctttgagttt-3′。PCR擴增管中添加DNA模板0.5 μL，正反向引物各0.6 μL，滅菌水22.4 μL，dNTP 2.4 μL，3 μL緩沖液，ExTaq酶0.5 μL。PCR反應程序：先94 ℃預變性10 min，然后進行30個循環(94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min)，最后72 ℃延伸10 min。
擴增結束后，運用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行檢測，使用Axyprep DNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN)切膠回收DNA。PCR擴增后的條帶亮度明顯，位置清晰，可直接用于后續測序分析。委托北京理化分析測試中心進行Illumina MiSeq高通量測序。
1.3 高通量測序數據分析
本研究采用Illumina MiSeq PE2 × 125測序方法進行測序。測序數據下機后，根據Barcode拆分不同樣本數據，并去除Barcode序列及引物序列，利用FastQC對序列進行質量控制。使用FLASH(v1.2.7，ccb.jhu.edu/software/FLASH/)根據overlap拼接Miseq雙端測序數據，拼接成功率控制在90%以上。利用QIIME(1.8，qiime.org/)過濾低質量序列，利用UCLUST (v1.2.22， http://www.drive5.com/uclust/downloads1_2_22q.html)對獲得的高質量序列進行操作分類單元(OTU)劃分，97%作為相似性閾值，并將獲得的OTU與SILVA(Realease123，www.arb-silva.de)非冗余度0.9的16S序列數據庫比對，獲得各OTU代表序列的分類信息。基于OTU的聚類結果，使用QIIME(1.8，qiime.org/)軟件計算各個樣本α多樣性，以反映本次測序深度、物種均勻性等，并根據注釋結果，計算樣本間距離矩陣，進行PCA可視化。利用ANOVA(analysis of variance)方法計算污水廠與反應器中門和綱水平上物種注釋的豐度差異情況。利用冗余分析(RDA)解析微生物與環境因子的相關性。實驗設計原始數據上傳NCBI網站，數據項目編號(BioSample accession)為SAMN08107549。
1.4 常規水質指標測定
廢水中常規指標檢測方法為：COD采用微波消解法;氨氮采用納氏試劑分光光度法(HJ 535-2009);硝態氮采用麝香草酚分光光度法(GB/T 5750.5-2006);亞硝態氮利用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法(GB/T 7493-1987);污泥濃度(MLSS)利用恒重法;pH采用PHB-2型pH計;DO采用LDO™ 便攜式溶氧儀。
1.5 統計分析
所得微生物群落結構數據利用SPSS 19.0軟件進行差異顯著性分析，P<0.05 表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。
2 結果與討論
2.1 水質處理效果分析
對污水廠和實驗室反應器AO工藝處理系統進行水質指標監測，分別共計142 d和45 d，其對氨氮和COD處理效果分別如圖2和圖3所示。
圖2 污水廠氨氮和COD去除效果
圖3 實驗室反應器氨氮和COD處理效果
由圖2可知，污水廠進水COD濃度為384~732 mg·L−1，最終出水COD濃度為24~145 mg·L−1，COD去除率為73.54%~96.52%，COD平均去除率為87.25%。污水廠進水氨氮濃度為256.0~491.0 mg·L−1，最終出水氨氮濃度為1.1~163.0 mg·L−1，氨氮去除率為64.15%~99.66%，氨氮平均去除率為89.57%。研究表明，淀粉工業廢水含有大量含碳有機物、含氮有機物以及多種微量元素，易被微生物利用分解。本研究中，污水廠污泥濃度前期較低，在運行第3天取樣，污泥濃度為2 215 mg·L−1。為了提高污泥硝化能力，污水廠提高生化池水溫，由29 ℃提高到34 ℃，同時延長污泥停留時間，到第132天所采樣品Z1、Z2污泥濃度已達到3 683 mg·L−1，COD和氨氮濃度去除效果逐漸提高。鄧仁建等研究發現，提高污泥濃度有助于提高COD和總氮去除率，在污泥濃度為4 300 mg·L−1時，SBR總磷去除率最高為75.6%。KAWASAKI等研究發現，污泥濃度較低時，有機物不能被完全降解;當污泥濃度維持在3 000~5 000 mg·L−1時，處理效果穩定。
由圖3可知，實驗室AO反應器進水COD濃度為315~478 mg·L−1，最終出水COD濃度為40~80 mg·L−1，COD去除率為78.57%~90.83%，COD平均去除率為84.22%。進水氨氮濃度為364~521 mg·L−1，最終出水氨氮濃度為49.9~434.7 mg·L−1，氨氮去除率為4.21%~88.50%，氨氮平均去除率為39.57%。反應器脫氮效率達到88.50%，認為反應器啟動成功。COD去除效果變化不明顯，前期污泥馴化階段直到最后，COD去除率均在90%以上，甚至出現0 mg·L−1，證明該實驗反應器進水可能存在碳源不足的情況，需外加碳源提高脫氮性能。前期(第1～10天)和中期(第11～35天)污泥馴化階段處理效果較差，后期(第36～45天)處理效果逐漸好轉，結果表明該淀粉工業污水處理廠的活性污泥對相同氨氮、COD濃度的淀粉工業廢水及葡萄糖模擬廢水均能達到較好的處理效果。鐘振興等通過接種實際污水廠好氧池污泥，以實驗室反應器處理模擬廢水時發現，COD和氨氮的去除率分別高達90.9%和90.4%，并基本保持穩定，這與本研究結果相一致。
2.2 微生物群落多樣性分析
為了進一步揭示AO工藝中污染物的去除途徑，采用Illumina高通量測序對活性污泥樣品中微生物菌群進行多樣性分析。如表1所示，7個樣品獲得的有效OTU數在1 087 ~1 628個之間，好氧池OTU數目在污水廠及反應器中均呈現下降趨勢，其原因可能是專屬菌群相對含量逐漸提高。Chao1指數側重于群落豐度，PD whole tree指數與Shannon指數側重于群落的多樣性，數值越大，群落多樣性越高，菌群覆蓋度指數(Goods coverage指數)用來表示本次測序相對于整體樣本的覆蓋程度，數值越高，覆蓋程度越高。
表1 活性污泥中菌群多樣性指數
由表1可知，在97%的相似水平上，Goods coverage指數均在94%以上，說明本次測序結果可充分反應微生物真實情況。Chao1指數在實驗室AO反應器的好氧段中整體高于污水廠，說明其物種豐富度較高，并且在各個樣品中，隨著水質好轉，Chao1指數呈現降低趨勢。而Shannon和Simpson指數在污水廠的好氧段中明顯低于AO反應器，表明生物多樣性在AO反應器中較高，且在污水廠中缺氧段豐富度和多樣性高于好氧段。上述結果原因可能是各個生物系統體系運行條件有差異，盡管2系統均能對氨氮、COD達到很好的去除效率，但物種多樣性及豐富度均存在差異，表明水質成分存在差異時，作用菌群差異較大。ZHANG等研究結果與本實驗結果類似，利用CA解析15個不同進水及工藝的污水處理廠微生物群落結構，相對距離為0.6 時，根據進水水質差異分為5組，進水水質差異是影響微生物多樣性和豐富度的關鍵因素。具體聯系污水寶或參見http://www.xhxdt.com更多相關技術文檔。
2.3 微生物群落多樣性的主成分分析
根據主成分分析得到各樣本OTU數據的因子載荷，其是污泥樣品中微生物群落結構和功能的具體反映。圖4為污水廠及AO反應器7個樣品的微生物群落主成分分析圖，反映了不同進水成分污泥樣品的因子載荷變化，樣本間空間距離較近，表明物種組成相對類似。如圖4所示，橫坐標PC1貢獻度為66.3%，PC2貢獻度為29.1%，PC3貢獻度為2.5%，污水廠樣品分布在一側，離散程度較高，實驗室AO反應器中W1、W2和W3微生物群落結構相似度較高。X1、X2距離相對于Z1和Z2較遠,W2、W3距離相對于W1距離較近。綜上分析，污水廠缺氧段好氧段中存在專屬菌群，其差異大，水處理效果良好，郭小馬等的研究結果與本研究結果類似，在COD和氨氮去除率分別達到81%和91%時，缺氧段與好氧段微生物種類無明顯差異但相對數量差異明顯。而實驗室AO反應器反應體系較小，微生物群落結構差異相對較小。
圖4 微生物群落多樣性的主成分分析
2.4 微生物菌群結構分析
在門、綱和屬水平上對測序結果進行歸類，分析所取4個污水站污泥樣品和3個反應器樣品在不同分類水平上的菌群組成及相對豐度差異，結果見圖5。
圖5 門水平下微生物群落相對豐度
由圖5可見，在門級別，淀粉工業污水廠中各樣品中(X1~Z2)共統計到51個菌門。Proteobacteria、Bacteroidetes、Chloroflexi、Firmicutes、Actinobacteria和Saccharibacteria在各樣本中為主要菌群，其在各階段總豐度平均為86.87%，且總體差異較小。對應AO反應器中，Proteobacteria、Bacteroidetes、Chloroflexi、Firmicutes總相對豐度達到73.12%~75.61%，為各樣本中絕對的優勢菌群，這與MA等和高晨晨等考察焦化廢水及9座不同污水處理廠，發現在處理不同進水及工藝存在差別時，主要優勢菌門為Proteobacteria、Bacteroidetes、Chloroflexi和Firmicutes，多樣性不隨水質工藝產生差異，但相對豐度有所不同，與本研究結論一致。各個階段微生物豐度變化較為明顯的為Proteobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes和Chloroflexi等。污水廠中，好氧池各樣品Proteobacteria、Bacteroidetes和Firmicutes相對豐度分別由23.78%、18.47%和17.81%增長為47.77%、26.36%和12.05%。而AO反應器中，Proteobacteria和Bacteroidetes分別由39.99%和6.62%增長為46.25%和21.93%。Chloroflexi在污水廠及反應器中分別由17.82%和21.48%降至12.04%和2.76%�？禃詷s[26]研究發現，Proteobacteria和Bacteroidetes隨著總氮和總磷去除率的提高，其豐度也相應增加，具有重要的硝化及反硝化除磷作用，而Firmicutes則與COD的去除有關。Chloroflexi優勢在各生物系統中減弱，可能是因為Chloroflexi為嚴格厭氧細菌，進入好氧段后，溶解氧的增加抑制了其生長代謝，而Z1，Z2之間可能是因為Proteobacteria世代時間相對于Chloroflexi較短，在反應器營養充分的條件下實現了更多的增殖。
對各樣品變形菌門微生物的分布特征進行分析，結果見表2。
由表2可知，所選4個樣品中Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria和Gammaproteobacteria是變形菌門中最優勢菌綱，并且呈一定增長趨勢。HU等研究發現，Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria和Gammaproteobacteria在脫氮過程中發揮了重要作用并與反應器氨氮濃度呈正相關。而在實驗室AO反應器中，除去Betaproteobacteria呈遞增趨勢，Alphaproteobacteria和Gammaproteobacteria均呈現先增后減的波動趨勢。根據YE等和王未青的研究，Alphaproteobacteria和Gammaproteobacteria參與硝酸鹽的還原，其從屬菌——聚糖菌又影響了生物除磷過程。在本次實驗中，實驗室AO反應器進水盡管保證了COD、氨氮等濃度一樣，但其中氮磷組成形式、微量元素及其他有機質的差異仍然影響了微生物群落構成。
在本階段所取的6個樣品中，共檢測出827種菌屬，其相對豐度如圖6所示。
圖6 屬水平下微生物群落相對豐度
由圖6可知，污水廠與實驗室AO反應器各樣品菌屬組成相似。優勢菌屬為Anaerolineaceae、Saprospiraceae和Betaproteobacteria等，三者總豐度占到了30%，而Saprospiraceae在污水廠中由8.89%降至1.04%，在AO反應器中由1.68%增為11.75%。有研究表明，Saprospiraceae能夠分泌胞外聚合物，代謝葡萄糖、半乳糖、醋酸鹽等，因AO反應器反應體系較小，微生物群落均能獲得足量葡萄糖、半乳糖等有機質，而污水廠X1、X2與Z1、Z2取樣點距離較遠，后期葡糖糖供給不足，致使Saprospiraceae大量較少。
以上2種污泥系統中AOB(Nitrosomonas，Nitrosospira)和NOB(Nitrospira，Nitrospina)種類完全一致，但相對豐度差異較大。AOB在污水廠和AO反應器中相對豐度分別為0.12%和0.07%，NOB分別為0.08%和0.21%。這可能是因為污水廠反應體系更為完整且缺氧池、好氧池等相對獨立，專屬菌群長勢良好。MA等研究發現，活性污泥中AOB和NOB相對豐度處于0.01%~1%的條件下，污水廠仍能保持高效脫氮。有研究表明，活性污泥中與反硝化作用有關的主要菌屬包括：Azoarcus、Thauera、Comamonas、Rhodobacter、Rhodocyclus和Dechloromonas等。在本研究中，也發現了Azoarcus、Thauera和Comamonas等可能參與反硝化作用的細菌類群，其相對豐度如表3所示。由表3可知，Comamonas為其中豐度最高菌群，且各菌屬隨水質變化成一定的演替規律。
表3 各樣品反
硝化相關菌群相對豐度
2.5 2種工藝微生物構成差異
ANOVA(analysis of variance)比較污水廠與實驗室AO反應器在不同分類水平上物種豐度差異[34]，結果見表4。
如圖7所示，在門水平上，厚壁菌門(Firmicutes)豐度在污水廠和反應器之間存在顯著差異，其豐度在污水廠中顯著高于反應器(P=0.002<0.01)，而變形菌門、擬桿菌門和綠彎菌門等無顯著差異(P>0.05)。在綱水平上，變形菌門中的Betaproteobacteria相對豐度顯著低于反應器(P=0.045<0.05)。厚壁菌門中的Bacilli、Negativicutes相對豐度污水廠顯著高于反應器(P=0.031、0.032<0.05)、Ignavibacteria則顯著高于反應器(P=0.004<0.01)。結合污水廠及實驗室AO小試裝置水質處理效果可知，菌群豐度的差異是進水水質成分差異造成，并且受水質處理效果影響。
表4 污水廠與反應器門、綱水平上物種相對豐度的差異
本研究選取污泥濃度(MLSS)、COD、氨氮(ammonia)和溫度(T)作為環境因子，結合各樣本微生物群落結構，利用冗余分析(RDA)研究微生物與環境因子的相關性。結果(見圖7)表明，主軸1和主軸2共解釋了微生物群落結構與水質參數總變異的80.31%，污水廠樣品中，X1、X2分布較近，與Z1、Z2相同，而實驗室AO裝置分布較遠，水質處理較差的W1、W2分布較近，而W3距離較遠。并且實驗室裝置前期受氨氮影響較大。X1、X2期間受COD影響較大，經調試污泥停留時間后，Z1、Z2污泥濃度增加。微生物群落中Corynebacterium和Saprospiraceae受COD影響較大，Comamonadaceae、Salmonella以及Variovorax受氨氮影響較大。Oxalobacteraceae及Lactobacillus與污泥濃度相關。
圖7 污水廠和反應器微生物RDA分析結果
3 結論
1) 進水COD、氨氮濃度分別為500、450 mg·L−1時，污水廠COD和氨氮出水濃度為83和1.3 mg·L−1,COD去除率為73.54%~96.52%，氨氮去除率為64.15%~99.66%。AO反應器出水濃度分別為78和107 mg·L−1，COD去除率為78.57%~90.83%，氨氮去除率為4.21%~88.50%。經過一定時間的調試污泥馴化后，工業污水廠活性污泥對人工配水保持較高的凈化效率。
2) 根據PCA分析，受反應體系影響，污水廠各樣品微生物群落結構離散程度較大，而AO反應器由于體系小，水質相對穩定，3個污泥樣品微生物群落結構差異相對較小。
3) 高通量測序結果表明，變形菌(Proteobacteria)、擬桿菌(Bacteroidetes)、綠彎菌(Chloroflexi)、厚壁菌(Firmicutes)、放線菌(Actinobacteria)和Saccharibacteria為污水廠和反應器中主要菌群，相對豐度為81.53%~92.36%。受水質成分影響，在污水廠系統和反應器中差異較為明顯的為Firmicutes和Betaproteobacteria和Saprospiraceae等。(來源：環境工程學報 作者：鄭向陽)
