1 引言(Introduction)

　　目前, 對(duì)顆粒污泥的研究多是關(guān)于如何快速培養(yǎng)、在不同進(jìn)水條件(酸化與部分酸化)、不同生產(chǎn)工藝條件及在不同反應(yīng)器中的特性等方面(郭徽等, 2018;邵享文等, 2018), 而關(guān)于含高濃度Ca2+的廢紙?jiān)旒垙U水對(duì)生產(chǎn)性規(guī)模IC厭氧反應(yīng)器中不同高度處顆粒污泥中古菌的影響還鮮見(jiàn)報(bào)道.產(chǎn)甲烷菌的最大產(chǎn)甲烷活性是評(píng)估顆粒污泥活性最重要的指標(biāo).產(chǎn)甲烷菌是一個(gè)特殊的、專門的生理群, 具有特殊的細(xì)胞成分和生理功能, 是嚴(yán)格的專性厭氧菌, 其產(chǎn)甲烷途徑有3種, 它們以乙酸、甲基化合物、H2/CO2為基質(zhì), 通過(guò)不同的反應(yīng)途徑形成甲基輔酶M, 在甲基輔酶M還原酶的催化下最終形成甲烷.產(chǎn)甲烷菌對(duì)pH、氧濃度的高度敏感和以H2/CO2為基質(zhì)產(chǎn)生甲烷的自養(yǎng)生長(zhǎng), 使產(chǎn)甲烷菌具有繁殖世代周期長(zhǎng)的特點(diǎn).因此, 一般情況下產(chǎn)甲烷是有機(jī)物甲烷化過(guò)程的限速步驟.有學(xué)者在研究高濃度造紙廢水厭氧處理中顆粒污泥的微生物多樣性時(shí)指出, 顆粒污泥中的古菌均為甲烷菌屬, 產(chǎn)甲烷菌包括食氫型產(chǎn)甲烷菌和食酸性型產(chǎn)甲烷菌兩個(gè)生理類群(尹礎(chǔ)等, 2008;易敏等, 2017).此外, 邢雅娟等(2019)在研究造紙廢水UMIC反應(yīng)器中微生物的縱向分布特性時(shí)也發(fā)現(xiàn), 系統(tǒng)內(nèi)古菌在門分類水平上多樣性較低, 主要是廣古菌門和深古菌門, 在屬水平上主要包括Methanosaeta、norank_p_Bathyarchaeotea、Methanobacterium、Methanosarcina等.李江等指出, 在厭氧反應(yīng)器中產(chǎn)生的CO2在水溶液中易生成HCO3-、CO32-, 再與系統(tǒng)中的Ca2+生成CaCO3沉淀在顆粒污泥的內(nèi)部或表面, 從而使顆粒污泥中大量的產(chǎn)甲烷活性受損(Yang et al., 2010;李江等, 2012).但目前還少有對(duì)CaCO3沉淀具體是影響甲烷菌的哪種類型進(jìn)行分析的研究.基于此, 本文針對(duì)造紙廢水中高濃度Ca2+與CO32-結(jié)合生成的CaCO3沉淀對(duì)顆粒污泥中產(chǎn)甲烷菌的影響進(jìn)行分析, 以期能為延緩顆粒污泥的鈣化提供一定的參考, 找出最適合處理廢紙?jiān)旒?A style="TEXT-DECORATION: none" href="http://www.xhxdt.com/">廢水的微生物種類和配比.

　　2 材料與方法(Materials and methods)

2.1 材料

2.1.1 厭氧顆粒污泥特性及水質(zhì)分析

　　取陜西某處理廢紙?jiān)旒垙U水的IC厭氧反應(yīng)器(進(jìn)水容積負(fù)荷為10~15 kg·m-3·d-1, HRT為5 h, 上升流速為5 m·h-1, 進(jìn)水量為600 m3·h-1)內(nèi)不同高度處的顆粒污泥(AS2), 其取樣口見(jiàn)圖 1(1#和6#取樣口因凍結(jié)堵塞未能取樣).種泥是河南某淀粉廠的厭氧顆粒污泥(AS1), 樣品于-20 ℃的冰箱中保存待測(cè).AS2顆粒較小, 平均粒徑為0.21 mm, 呈黑灰色.厭氧進(jìn)水及厭氧出水COD分別為2829、1151 mg·L-1, 去除率為59.31%.厭氧進(jìn)水和出水Ca2+濃度分別為6670、3893 mg·L-1, Ca2+在厭氧反應(yīng)器中的截留率為41.63%, AS2的其他特征見(jiàn)表 1.AS1的MLVSS/MLSS為93.46%, 顆粒較大, 平均粒徑為0.35 mm, 呈青黑色空心的球形, 表面光潔.

　　圖 1

 

　　圖 1 IC反應(yīng)器結(jié)構(gòu)示意圖

表 1 AS2不同高度的污泥特征

　　2.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品及主要設(shè)備

　　實(shí)驗(yàn)藥品無(wú)水乙醇、戊二醛、乙酸異戊酯、氯化鉀、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、溴化鉀、氯化鐵、磷酸鈉、無(wú)水氯化鈣均為分析純.主要儀器包括X射線衍射儀(XRD, D8 Advancee, 德國(guó)布魯克Bruker)、紅外光譜儀(IR, Vertex70, 德國(guó)布魯克公司)、掃描電鏡-能譜儀(SEM-EDX, COXEM, 捷克TESCAN)、烘箱(FCD-3000, Serials)、COD快速測(cè)定儀(5B-2F, 連華科技)、紫外-可見(jiàn)-近紅外分光光度計(jì)(Cary 5000, 美國(guó)安捷倫).

　　2.2 分析方法

　　每個(gè)待測(cè)樣品設(shè)置3個(gè)平行樣, 分別進(jìn)行如下的樣品預(yù)處理及測(cè)定.

　　2.2.1 顆粒污泥基本特征及水質(zhì)的測(cè)定

　　顆粒污泥的MLSS、MLVSS采用標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定, pH使用pH計(jì)測(cè)定, COD采用連華COD快速測(cè)定儀測(cè)定, 乙酸濃度采用乙酸鐵比色測(cè)定(薛超友等, 2018), 最后將各樣品3個(gè)平行樣的平均值作為測(cè)定結(jié)果計(jì)入表 1.

　　2.2.2 厭氧顆粒污泥的XRD分析

　　對(duì)厭氧顆粒污泥進(jìn)行預(yù)處理, 每個(gè)樣品的各平行樣各取50 mL, 然后在105 ℃下烘干至恒重, 再將烘干后的樣品置于馬弗爐中在600 ℃下灼燒4 h, 灼燒完成后, 將各樣品的3個(gè)平行樣進(jìn)行混合, 用石英研缽研細(xì)后粉體備用.利用XRD對(duì)污泥中的無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行晶型分析, 波長(zhǎng)為0.1540 nm, 管電壓為40.0 kV, 管電流為40 mA, 掃描范圍為10°~80°, 步長(zhǎng)為0.02, 掃描速度正常.

　　2.2.3 厭氧顆粒污泥的紅外光譜分析

　　每個(gè)樣品的各平行樣各取30 mL, 然后在40 ℃下烘干后將各樣品的3個(gè)平行樣進(jìn)行混合, 研磨成粉, 最后稱取0.01 g粉末樣品與1 g KBr混合均勻, 倒入壓片模中, 在10~80 MPa壓力下加壓1~2 min, 得到全透明壓片.以純KBr壓片作為背景值, 在紅外光譜儀中測(cè)量樣品的吸光度, 測(cè)定范圍為4000~500 cm-1.

　　2.2.4 厭氧顆粒污泥的掃描電鏡-能譜分析

　　① 取樣與清洗：每個(gè)樣品的各平行樣各取50 mL, 靜置10 min, 去除上清液, 加入pH=7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS, 由0.24 g KH2PO4、1.44 g Na2HPO4、8 g NaCl、0.2 g KCl加蒸餾水至1 L配制而成)至原體積, 并輕微振蕩混合, 沖洗3次, 以洗掉樣品表面的雜質(zhì)、粘液等附著物, 再靜置, 自然沉淀, 去除上清液;②固定：向清洗好的顆粒污泥中加入2.5%的戊二醛溶液并淹沒(méi)樣品, 并置于4 ℃冰箱中固定8 h;③沖洗：固定好的顆粒污泥用PBS沖洗3次, 每次10 min;④脫水：采用梯度乙醇脫水, 將沖洗好的樣品依次置于30%、50%、70%、90%、95%、100%(體積比)的乙醇中各浸泡15 min(其中, 95%和100%乙醇分別浸泡2遍);⑤置換：分別用體積比為1:1的乙酸異戊酯和乙醇的混合液及純乙酸異戊酯各置換1次, 每次15 min;⑥干燥：將置換后的樣品小心取出, 放入濾紙疊成的小盒中, 置于干燥器中干燥8 h, 干燥后將各樣品的3個(gè)平行樣進(jìn)行混合;⑦粘樣與噴金：將干燥且混合均勻的樣品用鑷子小心取出, 用導(dǎo)電膠把樣品粘附在鋁制托盤上, 之后在樣品表面用離子濺射鍍膜儀鍍一層金屬膜;⑧觀測(cè)：利用掃描電鏡掃描, 并用能譜儀分析元素組成.

　　2.2.5 厭氧顆粒污泥的古菌菌群生物多樣性分析

　　將樣品用冰袋冷凍運(yùn)輸至北京某基因科技有限公司完成PCR擴(kuò)增和測(cè)序, 具體步驟如下.

　　① 使用PowerSoil DNA Isolation Kit(MoBio Laboratories, Carlsbad, CA)提取樣品DNA, 在1%瓊脂糖凝膠上檢查基因組DNA的純度和質(zhì)量, 電泳條件：電壓170 V, 時(shí)間30 min.然后將基因組DNA于-20 ℃下保存.

　　② 用引物序列為5′-ACGGGGYGCAGCAGGCGC GA-3′、5′-GGACTACVSGGGTATCTAAT-3′, 對(duì)區(qū)域16S V3~V4(344F-806R)進(jìn)行PCR擴(kuò)增.對(duì)每個(gè)樣品, 將10位數(shù)的條形碼序列添加到正向和反向引物的5′末端(由Allwegene Company, Beijing提供).使用25 μL反應(yīng)液在Mastercycler Gradient(Eppendorf, Germany)上進(jìn)行PCR, 其中含有12.5 μL 2×Taq PCR MasterMix、3 μL BSA(2 ng·μL-1)、2 μL引物(5 μmol·L-1)、2 μL模板DNA和5.5 μL ddH2O.PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃變性5 min, 35個(gè)熱循環(huán)(94 ℃變性30 s, 63 ℃退火30 s, 72 ℃延伸60 s), 最后72 ℃延伸7 min.使用QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAGEN, Germany)純化PCR產(chǎn)物, 使用實(shí)時(shí)PCR定量, 并在公司進(jìn)行測(cè)序.

　　③ 在Allwegene公司的Miseq平臺(tái)上進(jìn)行深度測(cè)序.運(yùn)行后, 使用Illumina Analysis Pipeline Version 2.6進(jìn)行圖像分析、堿基調(diào)用和誤差估計(jì).

　　④ 通過(guò)Illumina平臺(tái)進(jìn)行Paired-end測(cè)序, 下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)去除低質(zhì)量reads(Q20, 90%標(biāo)準(zhǔn)過(guò)濾), 并剪除reads2尾部100 bp低質(zhì)量序列、引物序列.

　　⑤ 通過(guò)COPE軟件(Connecting Overlapped Pair-End, V1.2.3.3), 利用重疊關(guān)系將雙末端測(cè)序得到的成對(duì)reads組裝成一條序列, 利用內(nèi)部編寫程序去除兩端barcode序列、引物序列.Paired End Reads通過(guò)reads之間的overlap(19個(gè)堿基)關(guān)系拼接成Tags, 然后去掉barcode序列.為了得到高質(zhì)量的Tags, 將拼接的Tags按照長(zhǎng)度過(guò)濾, 進(jìn)行去嵌合體等處理.

　　3 結(jié)果分析(Results and analysis)3.1 厭氧顆粒污泥的XRD-EDS分析

　　如圖 2a所示, AS2顆粒污泥結(jié)晶度較好, 與標(biāo)準(zhǔn)卡片譜圖對(duì)比表明, 顆粒污泥中的結(jié)晶成分主要為無(wú)機(jī)鹽CaCO3, 且以方解石的形式存在, 還有部分CaCO3以次穩(wěn)定狀態(tài)的文石存在, 含有少量的FeCO3成分.AS2中5 m處顆粒污泥中除CaCO3外還含有草酸鈣和少量CaF2.如圖 1b所示, AS1顆粒污泥中的無(wú)機(jī)鹽主要是MgCO3、硅酸鈣, 還有少量CaCO3, 峰較為寬化, 非晶相較多.

　　圖 2

 

　　圖 2厭氧顆粒污泥X-射線衍射圖譜 (a.不同高度的AS2, b.AS1)

　　通過(guò)EDS分析檢測(cè)厭氧顆粒污泥內(nèi)的元素組成及比例, 結(jié)果如表 2所示.由表可知, IC反應(yīng)器中AS2隨著取樣高度的增加, Ca含量呈現(xiàn)先增加后減少的變化趨勢(shì), 但5、7、10 m處顆粒污泥的Ca含量(百分比)遠(yuǎn)高于2 m處顆粒污泥, 占1/3以上, 另外含量較高的是C和O元素, Mg、Fe等其他金屬元素含量較低.在AS1中Ca含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于AS2中, 僅占1.81%, 含量最大的是C元素, 其次是O元素, 說(shuō)明種泥中有機(jī)成分占主要地位.在AS2中, 隨著取樣高度的增加, 無(wú)機(jī)成分所占的比例也在增加, 這與表 1中MLVSS/MLSS的變化情況相符.結(jié)合XRD圖可進(jìn)一步確定AS2中Ca的主要存在形式是CaCO3, 再與AS1比較可知, 這種CaCO3的形成主要是廢紙?jiān)旒垙U水中高濃度Ca2+與CO32-結(jié)合而成.

　　表 2 顆粒污泥元素

　　

　　3.2 紅外光譜分析

　　為了比較IC反應(yīng)器中不同高度的顆粒污泥AS2和AS1化學(xué)結(jié)構(gòu)中各官能團(tuán)的分布情況, 對(duì)AS2和AS1進(jìn)行了紅外光譜分析(圖 3).AS2中2 m和7 m處顆粒污泥在一些特定區(qū)域(3300~2850、1750~1000、750~500 cm-1)存在相同的吸收帶, 但吸收峰分布有所差異.AS2中2 m處顆粒污泥在3696 cm-1處的吸收峰主要是由酸類物質(zhì)的—OH伸縮振動(dòng)導(dǎo)致(de Oliveira Silva et al., 2012;Liu et al., 2015), 這可能是因?yàn)檫@一區(qū)域主要發(fā)生了復(fù)雜有機(jī)物的水解酸化;各高度的AS2與AS1在3300~2850 cm-1處的吸收峰主要是由—OH和烷基上的不飽和—CH伸縮振動(dòng)導(dǎo)致;1690~1500 cm-1處是雙鍵的伸縮振動(dòng)區(qū);在1475~1000 cm-1處的吸收峰是X—H面內(nèi)彎曲振動(dòng)及X—H伸縮振動(dòng)區(qū).其中, 由于厭氧顆粒污泥成分的復(fù)雜性和蛋白質(zhì)的電負(fù)性, 使AS2 4個(gè)取樣口的泥樣都表現(xiàn)為CO32-特征, 在713、700~864、844~1090、1450~1410 cm-1之間有一定的吸收峰.AS2中7 m處顆粒污泥在1407.43 cm-1處的吸收峰是礦物質(zhì)中的—OH拉伸振動(dòng)導(dǎo)致;AS2中2、5、7 m處顆粒污泥在873~707 cm-1處出現(xiàn)的尖銳吸收峰代表芳香族化合物, 這主要是由于廢紙?jiān)旒垙U水成分較為復(fù)雜, 含有較多的芳香族化合物(陳永靜等, 2008), 被微生物吸附富集導(dǎo)致.AS1與AS2的7 m處顆粒污泥呈現(xiàn)較為相似的紅外吸收帶, AS1中主要為O—H、N—H的伸縮振動(dòng)和C—H的伸縮振動(dòng), 含較少的芳香族化合物, 沒(méi)有明顯的CO32-特征吸收峰帶, 這與XRD的分析結(jié)果大體上是相符的.具體聯(lián)系污水寶或參見(jiàn)http://www.xhxdt.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　圖 3

 

　　圖 3不同高度的AS2(a)和AS1(b)的紅外光譜

　　3.3 SEM分析

　　為了分析ICR反應(yīng)器中不同高度的AS2顆粒污泥和AS1的形態(tài)結(jié)構(gòu), 采用掃描電鏡(SEM)進(jìn)行分析, 結(jié)果如圖 4所示.AS2中2 m處的顆粒污泥內(nèi)除了分布有絲狀菌外, 還有少量桿菌和球菌, 同時(shí)還覆蓋有大塊的不規(guī)則沉淀物(圖 4 a1和a2);5 m處的顆粒污泥內(nèi)有大量粒狀的團(tuán)聚物和呈片狀的沉積物, 伴隨有少量的球菌及桿菌(圖 4 b1和b2);7 m處的顆粒污泥內(nèi)粒狀團(tuán)聚物和片狀沉積物更加密集, 孔隙中有桿狀菌存在(圖 4 c1和c2);10 m處的顆粒污泥因污泥濃度較低, 樣品處理后為稀少的粉末狀, 但仍可見(jiàn)顆粒內(nèi)有少量桿菌和球菌存在, 同時(shí)存在少量絮狀物(圖 4 d1和d2);與AS2相比, AS1則有大量規(guī)則排列的管狀孔隙(圖 4e1和e2), 這些孔隙就成了顆粒污泥中微生物產(chǎn)生的生物氣和水中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳輸通道, 一旦這些孔隙堵塞, 微生物的傳質(zhì)過(guò)程就會(huì)嚴(yán)重受阻, 微生物活性也因此降低.

　　圖 4

 

　　圖 4厭氧顆粒污泥的微觀形態(tài)結(jié)構(gòu) (a、b、c、d與e分別為AS2的2、5、7、10 m處及AS1的顆粒污泥電鏡掃描圖)

　　3.4 古菌菌群高通量測(cè)序結(jié)果及分析

　　本研究利用Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)對(duì)AS1及AS2的2、5、7 m處的顆粒污泥樣品進(jìn)行測(cè)序, 結(jié)果如下.

　　3.4.1 Alpha多樣性分析

　　Alpha多樣性是對(duì)單個(gè)樣品物種多樣性的分析, 基于OTU的結(jié)果, 計(jì)算了樣品的Alpha多樣性(圖 5).Chao1多樣性估算值是根據(jù)所測(cè)的tags數(shù)和OTU數(shù)量及相對(duì)比例來(lái)預(yù)測(cè)樣品中微生物的種類(OTU數(shù)量), 是基于已知結(jié)果所得的相對(duì)值.Shannon指數(shù)是一個(gè)綜合OTU豐度和OTU均勻度兩方面因素的多樣性指數(shù)(Navarrete et al., 2015;Sengupta et al., 2015).由圖 5和圖 6的稀疏曲線可知, AS1的Chao1、Shannon指數(shù)、PD_whole_tree(Phylogenetic diversity)等均高于AS2, 說(shuō)明種泥中物種更加豐富.稀疏曲線趨于平緩, 說(shuō)明對(duì)所取樣本微生物群落的檢測(cè)比率接近飽和, 測(cè)序數(shù)量和測(cè)序深度都已足夠反映樣本的真實(shí)情況, AS2不同高度顆粒污泥中古菌的生物多樣性由多到少排序?yàn)椋? m>2 m>7 m.

　　圖 5

 

　　圖 5 Alpha多樣性分析盒型圖

　　圖 6

 

　　圖 6 AS1和AS2樣品的稀疏曲線 (AS2-1、AS2-2、AS2-3分別代表AS2的2、5、7 m處樣本)

　　3.4.2 Beta多樣性分析

　　在0.97的相似度下, 得到了每個(gè)樣品的OTU個(gè)數(shù).PCA分析即主成分分析, 是將多維變量降成2個(gè)變量進(jìn)行分析.樣本的第一主成分貢獻(xiàn)率達(dá)79.95%, 第二主成分貢獻(xiàn)率達(dá)18.35%, 結(jié)果顯示, AS1與AS2各自聚為一類(圖 7a).Flower OTU分析結(jié)果顯示, 4個(gè)樣本中共有95個(gè)OTU數(shù), AS1中所特有的OTU數(shù)最多, AS2系統(tǒng)中5 m處樣品所特有的OTU數(shù)最多, 2 m處樣品次之, 7 m樣品處最少(圖 7b), 這與3.4.1節(jié)中的分析結(jié)果一致.

　　圖 7

 

　　圖 7 PCA分析(a)及Flower OTU分析(b)

　　聚類分析：基于Weighted Unifrac距離, 對(duì)樣本進(jìn)行聚類分析(張飛燕等, 2018;程立君等, 2019), 樣本層級(jí)聚類分析結(jié)果表明(圖 8), AS2-3樣本與AS2-2樣本聚到一起, AS2-1與AS2-2、AS2-3分開(kāi), 說(shuō)明AS2中2 m處的泥樣與5、7 m處的泥樣有一定的差異性, 而AS1與AS2的組成差異最大.

　　圖 8

 

　　圖 8樣本層級(jí)聚類分析

　　加權(quán)UniFrac的heatmap圖分析：通過(guò)對(duì)UniFrac結(jié)果的聚類, 具有相似Beta多樣性的樣品聚集在一起, 反映了樣品間的相似性(蘇瑤等, 2019), 具體結(jié)果如圖 9所示.根據(jù)顏色差異可以看出樣本之間的差異性, AS2中7 m處樣本與5 m處樣本相似性較高, 2 m處樣本與5、7 m處樣本具有一定的相似性, 結(jié)果與上述聚類分析的結(jié)果較為一致.

　　圖 9

 

　　圖 9加權(quán)UniFrac的heatmap

　　3.4.3 物種組成分析

　　門水平上菌群組成分析：AS1與AS2在門分類水平上的比較如圖 10所示.在AS1和AS2中占比最大的門類是廣古菌門, 所占比例都在90%以上;另一種主要的門類是深古菌門, 且AS1中深古菌門所占比例少于AS2中, 在AS2中隨著取樣高度的增加, 深古菌門所占的比例相對(duì)增加.深古菌具有多種生理生化功能, 參與甲烷代謝循環(huán), 產(chǎn)乙酸, 異化還原亞硝酸鹽和硫酸鹽, 能降解蛋白質(zhì)、多聚碳水化合物等有機(jī)質(zhì)(陳玉連等, 2017).廣古菌門包含了古菌中的大多數(shù)種類、產(chǎn)甲烷菌的全部(施嘉駿等, 2018)、極高鹽度下生活的鹽桿菌和一些超嗜熱的好氧和厭氧菌.

　　圖 10

 

　　圖 10門水平上的菌群組成

　　屬水平上的菌群組成：古菌在整個(gè)微生物體系中所占的比例較小, 但對(duì)整個(gè)厭氧系統(tǒng)有著至關(guān)重要的作用.此處將從屬分類水平上分析各樣本的古菌菌群組成(圖 11).在AS1中Methanosaeta(產(chǎn)甲烷絲菌)占42.53%, Methanolinea(產(chǎn)甲烷繩菌)占22.38%, 氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌Methanoregula占13.78%, Methanobacterium(產(chǎn)甲烷桿菌)占6.99%, Methanospirillum(產(chǎn)甲烷螺菌)占2.15%, 未鑒別的和其他菌類共占12.18%.可知AS1中的優(yōu)勢(shì)菌分別為產(chǎn)甲烷絲菌、產(chǎn)甲烷繩菌、Methanoregula、產(chǎn)甲烷桿菌和產(chǎn)甲烷螺菌, 其相對(duì)豐度都大于1%.在AS2中2 m處的優(yōu)勢(shì)菌分別為產(chǎn)甲烷絲菌(83.22%)、產(chǎn)甲烷繩菌(10.81%)、產(chǎn)甲烷螺菌(1.38%), Methanoregula降低到0.37%;相較于AS1, 產(chǎn)甲烷絲菌的占比增加了近1倍, 產(chǎn)甲烷桿菌、產(chǎn)甲烷繩菌和Methanoregula等占比減少, Methanosarcina(產(chǎn)甲烷八疊球菌)只占0.03%.在AS2中5 m處的優(yōu)勢(shì)菌分別為產(chǎn)甲烷絲菌(85.56%)、產(chǎn)甲烷繩菌(2.78%), 產(chǎn)甲烷八疊球菌、產(chǎn)甲烷螺菌、Methanoregula分別占0.61%、0.45%、0.28%.在AS2中7 m處的優(yōu)勢(shì)菌分別為產(chǎn)甲烷絲菌(89.86%)、產(chǎn)甲烷繩菌(1.43%)、產(chǎn)甲烷八疊球菌(1.21%), 產(chǎn)甲烷桿菌、Methanoregula、產(chǎn)甲烷螺菌分別占0.28%、0.26%、0.15%.由圖可知, 無(wú)論是在AS1中還是在AS2中最大的優(yōu)勢(shì)菌都是產(chǎn)甲烷絲菌, 但在AS2中產(chǎn)甲烷絲菌平均占86.21%, 相對(duì)豐度大幅度增加.

　　圖 11

 

　　圖 11屬水平上的菌群組成

　　在AS2中隨著高度的增加, 產(chǎn)甲烷八疊球菌和產(chǎn)甲烷絲菌的相對(duì)豐度呈現(xiàn)遞增的趨勢(shì), Methanoregula、產(chǎn)甲烷螺菌和產(chǎn)甲烷繩菌則呈現(xiàn)遞減的變化趨勢(shì).根據(jù)產(chǎn)甲烷菌可利用的底物類型, 可分為氫營(yíng)養(yǎng)型、乙酸營(yíng)養(yǎng)型和甲基營(yíng)養(yǎng)型3種.厭氧消化過(guò)程中代謝乙酸的產(chǎn)甲烷菌有兩類：產(chǎn)甲烷八疊球菌和產(chǎn)甲烷絲菌(楊秀山等, 1998), 產(chǎn)甲烷絲菌為顆粒污泥的形成提供了骨架, 從而加速了污泥的顆粒化進(jìn)程.有學(xué)者認(rèn)為在自然界中乙酸營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌的種類較少, 只有產(chǎn)甲烷絲菌和產(chǎn)甲烷八疊球菌, 但這兩種產(chǎn)甲烷菌在厭氧反應(yīng)器中居多, 特別是前者, 因?yàn)樵趨捬醴磻?yīng)器中乙酸是主要的產(chǎn)甲烷基質(zhì), 一般來(lái)說(shuō), 70%左右的甲烷來(lái)自乙酸的分解.而產(chǎn)甲烷八疊球菌中的Methanosarcina barkeri除了以乙酸為基質(zhì)外, 還能以甲醇、甲胺、H2/CO2為代謝基質(zhì)(端允等, 2010;Aresta et al., 2016;王祥錕等, 2016;Batsone et al., 2016;Zabranska et al., 2017).Methanoregula、產(chǎn)甲烷螺菌和產(chǎn)甲烷桿菌是氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌, 以H2/CO2和甲酸鹽為基質(zhì), 它們能夠利用H2為電子供體, CO2為電子受體, 通過(guò)電子傳遞還原CO2為CH4(Luo et al., 2016).由各樣本的菌群組成可知, AS1中氫營(yíng)養(yǎng)型甲烷菌和乙酸營(yíng)養(yǎng)型甲烷菌分別占45.29%、42.6%, 在IC反應(yīng)器中氫營(yíng)養(yǎng)型甲烷菌少于17%, 乙酸營(yíng)養(yǎng)型甲烷菌多于83.28%.可以看出, IC反應(yīng)器內(nèi)的CaCO3沉淀對(duì)顆粒污泥中的氫營(yíng)養(yǎng)型甲烷菌具有較大的抑制作用.

　　IC反應(yīng)器較大的高徑比將具有不同生理生態(tài)特征的微生物分布在反應(yīng)器的不同高度, 使其各自在適宜的環(huán)境條件下發(fā)揮最佳的代謝活性.有機(jī)物在厭氧消化過(guò)程主要包括水解發(fā)酵階段、產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸階段、同型產(chǎn)乙酸階段和產(chǎn)甲烷階段.在第一階段, 復(fù)雜有機(jī)物(如碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪等)轉(zhuǎn)化成小分子有機(jī)物, 如脂肪酸(丙酸、丁酸等)、簡(jiǎn)單基質(zhì)(甲胺、甲醇、甲酸、乙酸和H2/CO2等)及醇類物質(zhì), 兩個(gè)碳以上的有機(jī)酸不能被甲烷菌直接利用, 因此, 又在產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌的作用下分解成乙酸和CO2, 進(jìn)而為甲烷菌提供代謝基質(zhì).班巧英等(2018)的研究表明, 氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌比乙酸型產(chǎn)甲烷菌更耐酸, 氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌主要分布在ABR反應(yīng)器的1、2格室中, 乙酸營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌主要分布在3、4格室.在IC反應(yīng)器的下層首先進(jìn)行的是水解發(fā)酵, 此時(shí)丙酸是系統(tǒng)中的主要有機(jī)酸, pH較低, 乙酸營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌受到一定程度的抑制, 而氫營(yíng)養(yǎng)型的產(chǎn)甲烷菌具有更強(qiáng)的耐酸能力, 能與食丙酸菌協(xié)同作用, 利用丙酸等分解的H2/CO2及甲酸甲胺等物質(zhì), 更適應(yīng)這樣的酸性環(huán)境.隨著高度的上升, 乙酸濃度增加, 丙酸等濃度降低, 系統(tǒng)中pH也在增加(表 1), 生長(zhǎng)環(huán)境和代謝基質(zhì)方面都更加有利于乙酸營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌的繁殖, 最終表現(xiàn)為隨著反應(yīng)器高度的增加其數(shù)量也增加.

　　由以上的分析結(jié)果可知, AS1中氫營(yíng)養(yǎng)型甲烷菌占45.29%, 在IC反應(yīng)器中氫營(yíng)養(yǎng)型甲烷菌卻少于17%, 氫營(yíng)養(yǎng)型甲烷菌的相對(duì)豐度銳減, 表明CaCO3沉淀主要是對(duì)顆粒污泥中的氫營(yíng)養(yǎng)型甲烷菌具有較大的抑制作用.氫營(yíng)養(yǎng)甲烷菌是以H2/CO2為基質(zhì)產(chǎn)甲烷的一類自養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌, 通過(guò)提高這類甲烷菌的相對(duì)比例, 從而可以減少系統(tǒng)中的CO2含量, 同時(shí)又能降低系統(tǒng)的氫分壓, 最終可以促進(jìn)產(chǎn)甲烷階段的順利進(jìn)行, 又可以減弱系統(tǒng)中CO2對(duì)CO32-的貢獻(xiàn), 繼而減少Ca2+與CO32-結(jié)合生成CaCO3沉淀在顆粒污泥上, 最終能達(dá)到延緩顆粒污泥鈣化的目的.

　　4 結(jié)論(Conclusions)

　　1)在處理廢紙?jiān)旒垙U水的生產(chǎn)性IC反應(yīng)器內(nèi), 隨著反應(yīng)器高度的增加, 顆粒污泥中的無(wú)機(jī)成分也隨著增加;結(jié)合XRD和EDS結(jié)果分析可知, 顆粒污泥內(nèi)的無(wú)機(jī)成分主要是CaCO3, 而在種泥中的鈣含量只有1.81%, 顆粒污泥的有機(jī)質(zhì)含量較高.

　　2)顆粒污泥在高鈣廢水的長(zhǎng)期作用下, 隨著反應(yīng)器高度的增加, 氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌的相對(duì)豐度降低, 以Methanoregula、Methanospirillum和Methanolinea為代表, 乙酸營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌的相對(duì)豐度呈現(xiàn)遞增的趨勢(shì), 以Methanosarcina和Methanosaeta為例, Methanosaeta是各自系統(tǒng)中最主要的優(yōu)勢(shì)菌.IC反應(yīng)器中不同高度處古菌的生物多樣性由高到低的順序?yàn)椋? m>2 m>7 m, 5 m處的古菌物種更加豐富.

　　3)AS1和AS2顆粒污泥中古菌在門分類水平上主要包括Euryarchaeota和Bathyarchaeota, 兩者之和占90%以上.在屬分類水平上, 主要包括Methanosaeta、Methanoregula、Methanobacterium、Methanosarcina、Methanolinea、Methanospirillum等.

　　4)AS1中氫營(yíng)養(yǎng)型甲烷菌占45.29%, 在IC反應(yīng)器中卻少于17%, 可以看出, CaCO3沉淀使顆粒污泥的產(chǎn)甲烷活性降低, 主要表現(xiàn)為其對(duì)氫營(yíng)養(yǎng)型甲烷菌具有較大的抑制作用.(來(lái)源：環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào) 作者： 張安龍)