新型后置缺氧反硝化工藝因運(yùn)行操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用低等優(yōu)勢(shì)成為去除污水中營(yíng)養(yǎng)鹽的有效技術(shù)。該工藝的運(yùn)行效率受操作條件、原水水質(zhì)特征等因素的影響。之前的研究多集中于操作條件對(duì)新型后置缺氧反硝化工藝的影響，而對(duì)于水質(zhì)特征影響的研究較少。

污水中攜帶的重金屬會(huì)影響污染物及營(yíng)養(yǎng)鹽的轉(zhuǎn)化，并直接影響微生物代謝及關(guān)鍵酶活性，從而影響出水水質(zhì)。鉈（Tl）是地球上廣泛分布的劇毒性重金屬，被美國(guó)環(huán)保署和歐洲水框架組織列為優(yōu)先污染物之一。Tl在電子、半導(dǎo)體、制藥等領(lǐng)域具有廣泛的用途，但Tl的大量使用也導(dǎo)致相關(guān)污染事件頻發(fā)。水體內(nèi)Tl主要以兩種價(jià)態(tài)（Ⅰ價(jià)和Ⅲ價(jià)）存在，相較于Tl（Ⅰ），Tl（Ⅲ）對(duì)小球藻和大水蚤的毒性更強(qiáng)。但穩(wěn)定的Tl（Ⅰ）被認(rèn)為是大多數(shù)天然氧化水體中Tl的主要存在形式。目前，關(guān)于Tl毒性的研究對(duì)象多集中于魚(yú)類、藻類和無(wú)脊椎動(dòng)物等，而對(duì)于活性污泥效應(yīng)及其作用機(jī)制的探究相對(duì)較少。鑒于此，筆者考察了Tl對(duì)后置缺氧反硝化工藝運(yùn)行效能的影響，分析了Tl暴露條件下?tīng)I(yíng)養(yǎng)鹽的周期性轉(zhuǎn)化規(guī)律，解析了Tl對(duì)污泥特征的影響，最后通過(guò)16SrRNA高通量測(cè)序，從微生物群落結(jié)構(gòu)角度揭示了Tl對(duì)后置缺氧反硝化工藝的影響機(jī)制，旨在為降低Tl對(duì)污水生物處理的危害以及減少Tl在污水中遷移轉(zhuǎn)化風(fēng)險(xiǎn)提供參考。

1、材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用廢水為人工合成廢水，按照某礦業(yè)廢水成分配制并略有改動(dòng)。具體水質(zhì)如下：pH為6.9，COD為（412±12）mg/L，BOD5為（208±12）mg/L，TN為（68±3.2）mg/L，NH4+-N為（45±2.9）mg/L，PO43--P為（8.5±1.3）mg/L。實(shí)驗(yàn)所用碳源為乙酸鈉和丙酸鈉混合碳源（兩者質(zhì)量比為1∶1），氮源為氯化銨，磷源為磷酸二氫鉀。

接種污泥來(lái)源于某污水處理廠二沉池，取回后的剩余污泥經(jīng)人工去除雜質(zhì)后在實(shí)驗(yàn)室靜置24h，棄掉上清液。接種污泥的主要特征如下：總懸浮固體（TSS）為（5.6±0.5）g/L，揮發(fā)性懸浮固體（VSS）為（4.9±0.3）g/L，污泥體積指數(shù)（SVI）為（92.3±5.2）mL/g，COD去除率高達(dá)90%以上。

反應(yīng)器為玻璃樹(shù)脂制成的圓柱形反應(yīng)器，有效工作容積為6.0L，底部半徑和高分別為8.5和28cm，徑高比為0.3。距離底部5.0cm處設(shè)有直徑為2.0cm的進(jìn)水口，側(cè)面距離頂部5.0cm處設(shè)有直徑為2.0cm的出水口。SBR底部設(shè)有微孔曝氣盤，通過(guò)轉(zhuǎn)子流量計(jì)控制氣體流量以保證好氧階段的溶解氧濃度維持在3.0~5.0mg/L。將10.0mgTlCl溶于35℃的1.0L純凈水內(nèi)，制成母液，將Tl母液置于棕色錐形瓶?jī)?nèi)進(jìn)行避光保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

在5套相同的反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每套反應(yīng)器含有3個(gè)相同的SBR。首先，各SBR引入3.0L接種物和3.0L合成廢水，然后向各組反應(yīng)器內(nèi)加入不同體積的Tl母液，控制其濃度分別為0、5、25、50和100μg/L（分別為R0、R1、R2、R3、R4）。新型后置缺氧工藝每日運(yùn)行3個(gè)周期，每個(gè)周期的運(yùn)行模式如下：90min厭氧，120min好氧，90min缺氧，30min沉淀出水，150min閑置。每個(gè)周期排水，以控制水力停留時(shí)間為12h；每日在固定周期好氧階段排出泥水混合物133mL以控制污泥停留時(shí)間為15d。Tl母液每日只在一個(gè)周期投加一次，另外兩個(gè)周期進(jìn)水不含Tl母液。定期測(cè)定出水水質(zhì)，并結(jié)合污泥特征來(lái)判斷Tl對(duì)工藝的影響。實(shí)驗(yàn)在25~35℃的室溫環(huán)境下進(jìn)行。在80d時(shí)，測(cè)定污泥內(nèi)關(guān)鍵酶活性及微生物群落結(jié)構(gòu)，以揭示新型后置缺氧工藝對(duì)Tl的響應(yīng)機(jī)制。

1.3 分析項(xiàng)目及方法

COD、溶解性磷酸鹽（SOP）、TN及SVI的測(cè)定參照《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》（第4版）；TSS和VSS采用重量法測(cè)定。聚羥基脂肪酸酯（PHA）采用氣相色譜法測(cè)定，具體步驟如下：取10mL新鮮的顆粒污泥樣品置于離心管中高速離心，去除上清液，將剩余固體置于-80℃中冷藏24h后放入冷凍干燥機(jī)中24h；用電子天平稱量冷干后的樣品，取約10mg干燥的顆粒污泥于消解管中，加入2mL氯仿、2mL酸化甲醇溶液，在105℃烘箱中消解6h后進(jìn)行水解酯化反應(yīng)；進(jìn)行氣相色譜測(cè)定時(shí)，進(jìn)樣口溫度為200℃，載氣為N2，壓強(qiáng)為71.2kPa，流量為41.4mL/min，分流比為25/1，柱箱初始溫度為70℃，保持1min后以10℃/min上升到140℃，保持2min。EPS采用離子交換樹(shù)脂法提取，EPS內(nèi)蛋白質(zhì)（PN）和多糖（PS）分別采用福林酚法和蒽酮比色法測(cè)定，并分別用牛血清白蛋白和葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照物。糖原質(zhì)采用蒽酮比色法測(cè)定。細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）、過(guò)氧化氫酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）的分析見(jiàn)文獻(xiàn)。

微生物測(cè)序：待各組別運(yùn)行穩(wěn)定后，取50mL污泥樣品于-80℃條件下保存，樣品送往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)測(cè)定。采用341F（5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'）和785R（5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'）作為擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，樣品于IlluminaNovaSeq6000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。

2、結(jié)果與討論

2.1 Tl對(duì)出水水質(zhì)的影響

圖1為Tl對(duì)新型后置缺氧工藝出水COD的影響。

從圖1可以看出，Tl顯著影響了對(duì)COD的去除效果。穩(wěn)定期，空白組出水COD濃度維持在22.7~27.4mg/L，COD去除率高達(dá)91.6%~93.1%，說(shuō)明新型后置缺氧反硝化工藝能有效去除污染物。但當(dāng)存在Tl時(shí)，出水COD濃度顯著升高，COD去除率明顯下降。當(dāng)Tl濃度由5μg/L升高至100μg/L時(shí)，穩(wěn)定期出水COD濃度由58.1~64.4mg/L升高至124.5~134.8mg/L，相應(yīng)的COD去除率由81.2%~84.6%下降至61.6%~64.3%。上述結(jié)果表明，Tl能抑制后置缺氧工藝對(duì)污染物的去除效果，且Tl濃度越高，對(duì)去除COD的抑制效果越顯著。趙曉靜等在SBR內(nèi)探究Tl對(duì)COD去除率的影響發(fā)現(xiàn)，Tl能顯著抑制對(duì)污染物的去除效果，且移除Tl暴露后，COD去除率得以恢復(fù)。Tl的毒性高于Hg、Cu、Cd，本研究證實(shí)即使存在低濃度的Tl（5μg/L），長(zhǎng)期暴露同樣能抑制活性污泥系統(tǒng)去除污染物的效果。因此，在發(fā)生Tl暴露事件中應(yīng)注意其對(duì)污水處理效果的影響。

Tl對(duì)新型后置缺氧工藝去除營(yíng)養(yǎng)鹽的影響如圖2所示。

從圖2可知，Tl顯著影響了對(duì)TN和SOP的去除效果，且Tl濃度越高，營(yíng)養(yǎng)鹽去除率下降越顯著。在TN去除方面，20d后，當(dāng)Tl的濃度由5μg/L增加至100μg/L時(shí)，TN去除率由64.5%~66.8%下降至42.6%~45.8%。對(duì)TN的去除主要依賴微生物同化及反硝化菌的反硝化過(guò)程。一方面，高濃度Tl能降低活性污泥中有機(jī)質(zhì)濃度，進(jìn)而導(dǎo)致微生物同化消耗TN的能力受到抑制；另一方面，Tl的毒性抑制了反硝化微生物的代謝，從而導(dǎo)致生物脫氮過(guò)程被抑制。

在SOP去除方面，即使在長(zhǎng)期暴露中，低濃度Tl也顯著抑制了對(duì)SOP的去除。穩(wěn)定時(shí)期，當(dāng)Tl濃度由5μg/L增加至100μg/L時(shí)，SOP去除率由84.6%~86.9%下降至61.6%~64.5%。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，Tl可以顯著抑制新型后置缺氧工藝內(nèi)SOP的去除效果。聚磷微生物（PAO）代謝易受到重金屬的干擾，Tl的毒性能抑制PAO活性，從而降低對(duì)SOP的去除效果。

2.2 Tl對(duì)后置缺氧工藝內(nèi)污泥特征的影響

TSS及VSS/TSS是表征污泥特性的兩個(gè)重要指標(biāo)，Tl對(duì)TSS及VSS/TSS的影響如圖3所示。可見(jiàn)，空白組的TSS濃度維持在較高水平（4.19~4.25g/L）。但當(dāng)存在Tl時(shí)，TSS濃度受到顯著影響，且Tl對(duì)TSS的影響與Tl濃度密切相關(guān)。當(dāng)Tl濃度由5μg/L增加至100μg/L時(shí)，穩(wěn)定運(yùn)行期間TSS濃度由4.02~4.09g/L下降至3.18~3.36g/L。Tl的毒性能抑制微生物的增殖，從而降低了TSS濃度。Tl暴露組TSS下降也證實(shí)Tl抑制了微生物增殖，降低了微生物同化作用對(duì)TN和SOP的消耗，這也是導(dǎo)致高濃度Tl抑制后置缺氧工藝內(nèi)營(yíng)養(yǎng)鹽去除的原因之一。

從圖3（b）可以看出，與Tl對(duì)TSS的影響大致相似，Tl同樣降低了VSS/TSS。當(dāng)Tl濃度由5μg/L增加至100μg/L時(shí)，穩(wěn)定運(yùn)行期間VSS/TSS由79.5%~81.6%下降至62.3%~64.2%。Tl存在的組別內(nèi)，其VSS/TSS顯著低于空白組，說(shuō)明Tl降低了污泥中有機(jī)質(zhì)的占比。一方面，Tl的毒性抑制了微生物增殖，從而導(dǎo)致VSS濃度及占比下降；另一方面，Tl會(huì)導(dǎo)致污泥沉降性能下降（見(jiàn)圖4），致使部分污泥在沉淀/排水期未能完全沉降，從而引起部分VSS隨排水流失，降低了VSS濃度及其在TSS中的占比。

從圖4可以發(fā)現(xiàn)，空白組的SVI維持在84.6~89.2mL/g，污泥沉降性良好，且運(yùn)行期間基本維持穩(wěn)定。但存在Tl時(shí)，SVI出現(xiàn)不同程度的升高，且升高幅度與Tl濃度密切相關(guān)。當(dāng)Tl濃度為5和25μg/L時(shí)，穩(wěn)定期間SVI為91.3~94.6mL/g，兩者相差不明顯。但當(dāng)Tl濃度超過(guò)50μg/L時(shí)，SVI顯著升高，且當(dāng)濃度為100μg/L時(shí)，SVI提升至112.6mL/g，略有污泥膨脹趨勢(shì)。研究證實(shí)，活性污泥膨脹多數(shù)是由絲狀菌過(guò)度增殖引起的，相較于其他細(xì)菌，絲狀菌對(duì)外源重金屬具有更強(qiáng)的耐受性，向活性污泥系統(tǒng)中投加陽(yáng)離子重金屬（Cu2+、Fe3+）有利于好氧顆粒污泥的形成，提高污泥的沉降性。陽(yáng)離子重金屬能提高污泥分泌PN，提高污泥沉降性，而本研究則證實(shí)，即使低濃度Tl同樣提高了SVI值，降低了污泥的沉降性。Tl的毒性促使污泥分泌EPS尤其是PS，污泥外側(cè)帶有相同類型的電荷增加了排斥力，降低了污泥的沉降性。

EPS是微生物自發(fā)聚集形成的高分子聚合物，是活性污泥的重要組成部分。外源性Tl同樣會(huì)影響EPS的含量及組成。圖5為Tl對(duì)后置缺氧工藝EPS含量及組分的影響。

由圖5（a）可知，空白組EPS含量為89.5~94.3mg/g。而Tl的存在提高了EPS含量，且Tl的暴露濃度越高，EPS增加越顯著。當(dāng)Tl濃度為100μg/L時(shí)，穩(wěn)定運(yùn)行期間EPS含量升至145.6~149.8mg/g，遠(yuǎn)高于其他組別。有研究證實(shí)，當(dāng)微生物受到外源刺激時(shí)會(huì)分泌大量EPS進(jìn)行自我防御，這也是導(dǎo)致各組EPS含量升高的原因。EPS的主要成分為PN和PS，從圖5（b）、（c）可以發(fā)現(xiàn)，Tl同步提高了PN和PS的含量。在污泥系統(tǒng)中，適量外源性金屬離子容易刺激PS含量的增加，進(jìn)而提高污泥沉降性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，相比于PS，Tl暴露組別內(nèi)PN含量增加更顯著，見(jiàn)圖5（d）。例如，在Tl濃度為100μg/L的條件下，100d時(shí)PN/PS升高至1.81，遠(yuǎn)高于空白組的1.62，其他含Tl的組別類似。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Tl促進(jìn)了PN和PS含量的增加，并提高了PN/PS值。

2.3 Tl對(duì)微生物代謝活性的影響

ROS、CAT和SOD對(duì)Tl的響應(yīng)特征如圖6所示。可以發(fā)現(xiàn)，上述關(guān)鍵酶相對(duì)活性的變化同樣與Tl的濃度密切相關(guān)。當(dāng)Tl的暴露濃度低于5μg/L時(shí)，上述三種酶的變化可以忽略不計(jì)，說(shuō)明低濃度Tl未影響關(guān)鍵酶的相對(duì)活性。低濃度Tl引起污染物和營(yíng)養(yǎng)鹽去除率下降的原因可歸咎于Tl對(duì)功能微生物代謝的影響。然而當(dāng)Tl暴露濃度超過(guò)25μg/L時(shí)，ROS活性顯著升高，并伴隨著CAT和SOD的活性下降。尤其當(dāng)Tl濃度為100μg/L時(shí)，ROS相對(duì)活性升高至185%，而CAT和SOD的相對(duì)活性下降至52%和60%。暴露于低濃度Tl的組別，微生物自身裂解產(chǎn)生ROS可通過(guò)CAT和SOD進(jìn)行移除。研究證實(shí)，過(guò)高濃度的ROS容易導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，從而降低微生物代謝活性。污泥內(nèi)微生物為適應(yīng)Tl脅迫而產(chǎn)生大量ROS，低劑量Tl時(shí)活性污泥產(chǎn)生的ROS能很快被CAT和SOD消除，而高劑量Tl脅迫產(chǎn)生的ROS進(jìn)一步驗(yàn)證了微生物代謝活性下降。

2.4 Tl對(duì)后置缺氧工藝胞內(nèi)聚合物產(chǎn)量的影響

PHA和糖原質(zhì)是活性污泥系統(tǒng)內(nèi)重要的胞內(nèi)聚合物，Tl暴露會(huì)影響PHA和糖原質(zhì)的含量，結(jié)果如圖7所示。可知，當(dāng)Tl低于5μg/L時(shí)，對(duì)PHA無(wú)明顯影響，說(shuō)明活性污泥內(nèi)微生物為適應(yīng)低濃度Tl，脅迫強(qiáng)化PHA代謝以維持細(xì)胞正常水平。然而Tl超過(guò)25μg/L時(shí)則顯著降低了PHA的生物合成，且Tl的暴露濃度越高，PHA合成受抑制越顯著。當(dāng)Tl暴露濃度由25μg/L提高至100μg/L時(shí)，PHA的最大合成量由5.48mmol/g下降至5.01mmol/g。高濃度Tl抑制了PHA的合成。PHA在后置缺氧工藝中發(fā)揮著重要作用，能在好氧期分解產(chǎn)能用于好氧吸磷，同時(shí)可以作為電子供體在缺氧期進(jìn)行反硝化脫氮。高濃度Tl降低了PHA的合成，進(jìn)而影響了生物脫氮除磷效率。

糖原質(zhì)是活性污泥中重要的胞內(nèi)聚合物，其代謝變化與活性污泥中聚糖微生物密切相關(guān)。聚糖菌（GAO）是一類對(duì)除磷無(wú)貢獻(xiàn)但能與PAO競(jìng)爭(zhēng)有限碳源的微生物。GAO富集容易消耗廢水中的有限碳源，進(jìn)而降低生物脫氮除磷效果。本研究發(fā)現(xiàn)Tl提高了糖原質(zhì)的代謝，即使在低濃度Tl下，糖原質(zhì)的最大含量升高至6.74mmol/g，高于空白組的6.51mmol/g。進(jìn)一步提高Tl濃度至100μg/L時(shí)，糖原質(zhì)含量增加至7.24mmol/g。糖原質(zhì)代謝旺盛反映活性污泥系統(tǒng)中GAO豐度較高，進(jìn)而不利于污染物和營(yíng)養(yǎng)鹽的去除，這與前述結(jié)果一致。

2.5 Tl對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

后置缺氧工藝中污染物和營(yíng)養(yǎng)鹽的去除需要多種微生物共同驅(qū)動(dòng)完成，Tl暴露會(huì)影響活性污泥系統(tǒng)中微生物的群落結(jié)構(gòu)，如圖8所示。從圖8（a）可知，在門水平上，Cyanobacteria、Proteobacteria和Actinobacteriota是各組中的優(yōu)勢(shì)微生物，三者占比之和超過(guò)48.1%。Tl會(huì)影響微生物在門水平上的相對(duì)豐度，對(duì)于空白組和低濃度Tl組別，Proteobacteria的相對(duì)豐度高達(dá)13.5%~14.6%，而在超過(guò)25μg/L的Tl暴露組別，其相對(duì)豐度下降至10.9%~12.6%，而且Tl的濃度越高，Proteobacteria的相對(duì)豐度下降越顯著。有研究證實(shí)，Proteobacteria是一類能進(jìn)行生物脫氮的微生物，其還能有效利用廢水中的碳源。Proteobacteria相對(duì)豐度的下降在一定程度上降低了后置缺氧反硝化工藝對(duì)污染物的去除效果和生物脫氮性能。Firmicutes是一類厭氧微生物，其含有多種去除污染物的微生物。高濃度Tl組別內(nèi)Firmicutes的相對(duì)豐度下降至7.5%，低于空白組的8.9%。

在反應(yīng)器中近18種屬水平的微生物被發(fā)現(xiàn)，且相對(duì)豐度占比較高。由圖8（b）可知，Tl同樣能影響微生物在屬水平上的分布。空白組和低劑量Tl組別內(nèi)Chloroplast的相對(duì)豐度高達(dá)28.9%~29.6%，而超過(guò)50μg/L的組別，Chloroplast的相對(duì)豐度下降至20.2%~22.6%。Chloroplast屬于藍(lán)藻細(xì)菌，能有效利用外源污染物進(jìn)行代謝。高濃度Tl降低了Chloroplast的相對(duì)豐度，這與其抑制COD去除相關(guān)。Devosia含有反硝化功能基因如nirS2、narG、hzsB、nirK1和nirK2，從而對(duì)生物脫氮具有重要意義。高濃度Tl同樣降低了Devosia的相對(duì)豐度，尤其是100μg/L的組別，Devosia的相對(duì)豐度下降至10.8%。高濃度Tl能改變微生物在屬水平上的相對(duì)豐度，從而影響后置缺氧工藝的運(yùn)行效能。

3、結(jié)論

重金屬Tl能抑制后置缺氧工藝對(duì)污染物和營(yíng)養(yǎng)鹽的去除，且Tl暴露濃度越高，抑制污染物和營(yíng)養(yǎng)鹽去除的效果越顯著。重金屬Tl能影響后置缺氧工藝中污泥的特征，降低TSS濃度及VSS/TSS值，刺激EPS合成，并提高PN和PS含量。但高濃度Tl抑制了內(nèi)聚物PHA的合成并促進(jìn)了糖原質(zhì)代謝。超過(guò)25μg/L的Tl抑制了ROS、CAT和SOD等關(guān)鍵代謝酶的活性，并降低了門水平的Proteobacteria以及屬水平上Chloroplast、Devosia微生物的相對(duì)豐度。（來(lái)源：黃河水利職業(yè)技術(shù)學(xué)院環(huán)境工程學(xué)院，河南廣電計(jì)量檢測(cè)有限公司）