蜜餞生產(chǎn)在腌漬漂洗過程中產(chǎn)生大量廢水，具有高鹽度（3%~5%）、高COD（6000~20000mg/L）、高C/N值、水質(zhì)呈酸性（pH=2.5~4.0）的特點。若未經(jīng)有效處理而排放，不僅污染水體、危害水生生物，甚至可能破壞當?shù)厣鷳B(tài)系統(tǒng)。與物化處理方法相比，生物處理方法具有成本低、處理水量大、處理效果好、易于實施等優(yōu)點，因此在實際工程中生物法是蜜餞廢水處理的首選方法，但多數(shù)蜜餞廢水處理工藝需要將廢水pH調(diào)節(jié)至中性，藥劑成本高，而且可能會引入其他污染物。
在生物處理過程中，高鹽度會增加水的密度，從而影響活性污泥沉降性能，同時破壞微生物細胞內(nèi)外滲透壓平衡，降低酶活性，甚至引起微生物脫水和死亡。如果通過加水稀釋降低廢水鹽度，會導致處理水量成倍增加，池容相應(yīng)增大，處理成本顯著提高。此外，較低的pH會降低微生物豐度，抑制生化反應(yīng)。調(diào)節(jié)pH需要消耗大量藥劑，而多種蜜餞廢水（如金桔、李子、楊梅廢水）在pH升高后會產(chǎn)生凝膠狀物質(zhì)而導致廢水黏稠，為后續(xù)混凝處理及曝氣充氧帶來困難。蜜餞廢水的酸性pH由酸性有機物（如果酸和檸檬酸）、無機酸（如焦亞硫酸鈉）共同作用形成，酸性有機物的降解可以實現(xiàn)廢水pH的提升和COD濃度的降低。鑒于此，筆者提出投加耐鹽耐酸菌劑，以期在不加堿、不稀釋情況下實現(xiàn)高鹽酸性廢水的高效處理，目前關(guān)于此種方法在酸性高鹽廢水處理中的應(yīng)用鮮有報道。該研究采用序批式生物膜反應(yīng)器（SBBR），在鹽度分別為3.5%和5.0%，進水初始pH分別為2.6、3.3和4.0的條件下接種Candida菌劑，掛膜完成后考察污染物去除性能和微生物群落結(jié)構(gòu)變化。
1、材料與方法
1.1 實驗裝置
采用4個SBBR在不同鹽度和初始pH下開展實驗，具體如下：R1（pH=4.0，鹽度=5.0%）、R2（pH=2.6，鹽度=3.5%）、R3（pH=3.3，鹽度=3.5%）、R4（pH=4.0，鹽度=3.5%）。SBBR反應(yīng)器為圓柱形，直徑為10cm，高度為30cm，有效容積為2L；底部設(shè)有曝氣頭，曝氣頭上部放置邊長為1.5cm的立方體聚氨酯填料，填料體積約占反應(yīng)器有效容積的30%。SBBR運行周期為48h，包括進水0.25h、曝氣47.5h、沉降0.25h、排水。進水階段從反應(yīng)器頂部緩慢加入1.5L新鮮蜜餞廢水，處理過程中DO濃度保持在5mg/L以上。
1.2 廢水來源和Candida接種液
蜜餞廢水取自廣東省揭陽市某李子加工廠的污水儲備池，其COD、TN、NH4+-N、NO3--N、NO2--N、TP均值分別為（12000±2000）、（211±28）、（138±21）、（71±18）、0、（20±5）mg/L，鹽度為3%~5%（以NaCl計的鹽度為30~50g/L），pH在2.6~4.0之間波動（以3.3居多）。不同批次廢水水質(zhì)變化較大，現(xiàn)場調(diào)節(jié)池內(nèi)的鹽度一般控制在3.5%以下。因此該研究在3.5%鹽度下考察不同pH的影響，同時研究5.0%鹽度條件下反應(yīng)器的運行效果。將原廢水作為R1進水，調(diào)節(jié)pH至4.0，保持5.0%的鹽度，記作進水1；將原廢水稀釋到70%左右使鹽度降至3.5%，記作進水2，然后調(diào)節(jié)pH分別為2.6、3.3和4.0左右，分別作為R2、R3、R4的進水。調(diào)節(jié)pH所用試劑為H2SO4和NaOH溶液。
該研究使用的酵母菌Candida篩自某蜜餞廢水處理廠的調(diào)節(jié)池，其在酸性高鹽條件下具有較強的存活能力和較高的生長速率。將Candida的發(fā)酵液接種至SBBR，室溫條件下運行一周完成掛膜，肉眼可見聚氨酯填料表面布滿白色菌體。
1.3 DNA提取和擴增子測序
在每個實驗階段結(jié)束后，取40mL水樣及若干填料，振蕩搖晃使填料上的污泥脫落，離心收集污泥樣品。總DNA采用OMEGA試劑盒E.Z.N.A.®SoilDNAKit進行提取。細菌16SrRNA基因的V3-V4區(qū)采用引物338F和806R進行擴增，真菌ITS1區(qū)采用引物ITS1F和ITS2R進行擴增。
聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）擴增參數(shù)如下：在95℃預變性3min，在95℃變性30s，在55℃退火30s，在72℃延伸30s，重復27個循環(huán)，最后在72℃穩(wěn)定延伸10min，于4℃下保存。樣品委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司在IlluminaPE300平臺進行測序。
1.4 水質(zhì)分析方法
每隔2d從SBBR的進出水取樣10mL，經(jīng)0.22µm醋酸纖維濾膜過濾。COD、NH4+-N、NO2--N、NO3--N、TP均采用國家標準方法測定；總無機氮（TIN）為NH4+-N、NO2--N、NO3--N之和；DO采用溶氧儀測定；pH采用pH計測定；鹽度采用便攜式電導率儀測定。
2、結(jié)果與討論
2.1 SBBR對蜜餞廢水的處理效果
4個SBBR反應(yīng)器處理蜜餞廢水過程中pH的動態(tài)變化見圖1。反應(yīng)器R1~R4的ΔpH（出水pH與進水pH之差）分別為1.91±0.24、0.17±0.19、0.56±0.39、2.20±0.21；初始pH越高，出水pH提升越大；當初始pH=4.0時，出水pH穩(wěn)定在6.0左右，并且鹽度提升對出水pH的影響較小。這表明生物強化后的反應(yīng)器能夠抵抗酸性環(huán)境的影響，在3.5%~5%的鹽度下實現(xiàn)了穩(wěn)定的pH提升，這有利于減少藥劑投加量，降低運行成本。未加入硫酸時，pH的迅速升高可能是因為酸性有機物被降解而自然提升，然而加入硫酸使初始pH<4.0時，出水pH提升不明顯，無法升至近中性，這可能是因為微生物降解無法消耗硫酸，強酸環(huán)境也影響微生物的活性，致使pH上升較慢。
4個SBBR反應(yīng)器對蜜餞廢水中COD、TIN和TP的去除效果見圖2。由圖2（a）可知，在3.5%的鹽度下，反應(yīng)器R2、R3、R4運行6d后對COD的去除率分別升至50.1%、61.1%、83.2%，運行10d后趨于穩(wěn)定，pH變化對COD去除效果的影響較大。圖2（b）顯示，TIN的去除率變化趨勢與COD基本一致。圖2（c）顯示，TP的去除率變化趨勢與COD和TIN略有不同，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，10d后保持相對穩(wěn)定。綜上所述，在3.5%的鹽度下，反應(yīng)器運行10d后可以實現(xiàn)穩(wěn)定運行，進水pH越高，反應(yīng)器的處理效能越好。低pH抑制了反應(yīng)器對COD、TIN和TP的去除能力，此時菌株酶活性和生物膜結(jié)構(gòu)完整性下降，這是導致污染物去除率降低的重要因素。當pH=4.0時，對比R1（pH=4.0，鹽度=5.0%）和R4（pH=4.0，鹽度=3.5%）可以發(fā)現(xiàn)，兩個反應(yīng)器達到穩(wěn)定狀態(tài)所需時間幾乎一致，但R1前期對COD、TIN、TP的去除率較低，啟動速度更慢，各項指標的去除率均低于R4。考慮到R1的有機負荷較高，實際去除的有機物量要高于R4，因此在pH=4.0的情況下，經(jīng)生物強化后的反應(yīng)器可以耐受5.0%的鹽度并發(fā)揮良好的處理效能。
綜上，在初始pH為2.6~4.0、鹽度為3.5%~5.0%的條件下，各反應(yīng)器的啟動時間均在10d左右，能夠快速啟動并提升pH，污染物去除率隨著pH的升高而升高，隨著鹽度的升高而降低。該研究結(jié)果證實了在高鹽低pH條件下采用Candida進行生物強化，無需對廢水進行稀釋也可以實現(xiàn)碳、氮、磷的高效去除，同時實現(xiàn)pH的提升。在實際處理中，廢水的設(shè)計停留時間一般大于2d，因此可以達到更高的污染物去除率；另外，先去除大量有機物后再投加片堿，可以緩解廢水發(fā)黏的情況，有利于減少曝氣量和污泥量，從而降低廢水處理成本。
2.2 pH對微生物豐富度和多樣性的影響
為獲取SBBR系統(tǒng)中的微生物群落信息，采用IlluminaMiSeq測序平臺對生物膜樣品進行分析。R1、R2、R3、R4和RS（原廢水）樣本的微生物有效序列分別被分類為128、356、156、187和970個操作分類單位（ASVs），如表1所示。Ace和Chao指數(shù)可以指示微生物群落的豐富度，Shannon和Simpson指數(shù)可以指示微生物群落的多樣性。
除原廢水樣本RS外，其余樣本序列的覆蓋率均大于0.99，表明所獲得的序列足以覆蓋大多數(shù)微生物菌屬。RS細菌群落的Chao指數(shù)為1125.67，R1~R4分別降為140.00、383.16、148.54、185.08；RS真菌群落的Chao指數(shù)為22.20，R1~R4分別降為18.50、12.00、21.00、21.00。結(jié)果表明，pH最低時細菌豐富度最高，真菌豐富度最低，隨著pH升高，細菌豐富度先降低后升高，真菌豐富度逐漸升高。同時，不同SBBR中細菌的Chao指數(shù)均高于真菌，說明細菌的豐富度高于真菌。細菌群落的Shannon指數(shù)在R1~R4中從初始的4.57分別降至2.59、3.00、2.73、2.99。真菌群落的Shannon指數(shù)在R1~R4中從初始的1.37分別變?yōu)?/span>1.17、0.18、1.63、2.01。這說明，原廢水中的大部分細菌和真菌不適應(yīng)高鹽強酸環(huán)境，在處理過程中大部分被淘汰。
基于維恩圖分析了鹽度為3.5%時不同SBBR中ASVs水平的微生物差異和相似性，結(jié)果如圖3所示。不同SBBR中共有的細菌ASVs（2個）所屬為Oceanobacillus、Acidovorax，共有的真菌ASVs（3個）所屬為Candida、Kazachstania。原廢水中細菌和真菌的特有ASVs數(shù)目分別為853和14。在R2、R3和R4反應(yīng)器中，獨特細菌ASVs數(shù)目分別為288、73、118；獨特真菌ASVs數(shù)目分別為2、5、9。這說明不同SBBR中形成了獨特的微生物群落結(jié)構(gòu)。
2.3 pH對微生物群落組成的影響
微生物群落在門水平上的分布與組成見圖4。在門水平上，SBBR中細菌主要包括Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidota，真菌主要包括Ascomycota和Basidiomycota。Proteobacteria最常出現(xiàn)在高濃度工業(yè)廢水處理系統(tǒng)中，Proteobacteria的優(yōu)勢地位可以使得系統(tǒng)對氨氮保持高效且穩(wěn)定的去除效果。Bacteroidetes被認為是海洋環(huán)境中最豐富的異養(yǎng)細菌之一，在有機物的降解中起著關(guān)鍵作用，而在該研究中Bacteroidota不能適應(yīng)pH圖5為綱水平微生物群落結(jié)構(gòu)。R2、R3、R4中的主要優(yōu)勢細菌分別為Gammaproteobacteria、Bacilli、Alphaproteobacteria。在R2、R3、R4中，Bacilli的相對豐度分別為8.79%、52.76%和0.52%，這表明Bacilli在酸性環(huán)境下富集，同時適應(yīng)的pH范圍較小，僅在pH為3.3時占優(yōu)勢。在R2、R3、R4中，作為各反應(yīng)器中最豐富的變形菌門中的兩個綱，Gammaproteobacteria和Alphaproteobacteria呈現(xiàn)不同的變化趨勢，隨著pH的增加，Gammaproteobacteria的相對豐度逐漸降低，而Alphaproteobacteria的相對豐度則先降低后升高。Alphaproteobacteria是一種需氧或兼性細菌，包含能夠降解有機物的異養(yǎng)菌和化能自養(yǎng)菌，通常在廢水處理的生物膜中占據(jù)主導地位，其與Gammaproteobacteria在高鹽條件下共同參與有機物氧化和氮轉(zhuǎn)化過程。但該研究發(fā)現(xiàn)，當pH降低，而Microbotryomycetes的相對豐度逐漸升高，群落結(jié)構(gòu)的多樣性有助于微生物形成復雜的共生關(guān)系。
進一步使用Circos圖對屬水平上的微生物群落組成進行描述，結(jié)果見圖6。不同進水pH的3組SBBR中細菌群落結(jié)構(gòu)均發(fā)生了明顯變化，原廢水中大部分細菌被淘汰。R2中的優(yōu)勢屬為Acidovorax，占比達到46.90%，Acidovorax可參與廢水中復雜有機物的降解，同時具有高效的脫氮除磷能力，在中性條件下使用材料固定化后，可以提高對污染物的降解效率。R3中的優(yōu)勢屬為Oceanobacillus，占比為45.98%，該菌在高鹽條件下具有降解復雜有機物的能力。R4中的優(yōu)勢屬為Pseudooceanicola，占比達到了29.05%，Pseudooceanicola可以提高微生物對氮和磷的去除率，加速抗生素和重金屬的去除。3組反應(yīng)器中的優(yōu)勢細菌各不相同，并且在其他反應(yīng)器中幾乎檢測不到，這說明不同pH構(gòu)建了差異顯著的細菌生態(tài)結(jié)構(gòu)，這種差異可能會影響對廢水的處理效果。
3組SBBR的真菌群落結(jié)構(gòu)也發(fā)生了明顯變化，原廢水中的Kazachstania和Zygosaccharomyces在3組反應(yīng)器中幾乎檢測不到。R2中的優(yōu)勢屬為Zygoascus，在R2、R3、R4中的占比分別為96.42%、23.46%和3.82%；R3和R4的優(yōu)勢屬均為Candida，在R2、R3、R4中的占比分別為0.12%、65.40%和52.74%。這說明當pH為2.6時，Zygoascus更能占據(jù)主要生態(tài)位，而投加的Candida則更適應(yīng)pH≥3.3的酸性廢水環(huán)境。此外，真菌種類隨著pH的升高而升高，這說明酸性抑制了微生物多樣性，當pH提升至4.0時，真菌多樣性最高，同時污染物降解率達到最高。Zygoascus可以耐受較低pH和6.0%以下的鹽度，但常規(guī)污水處理一般在中性條件下，因此在污水處理中的相關(guān)報道較少。研究人員已證明，Candida與活性污泥系統(tǒng)進行耦合可以實現(xiàn)碳、氮、磷的同時高效去除，接種至UASB反應(yīng)器中可以處理高濃度有機廢水，但在酸性高鹽廢水中的應(yīng)用則鮮有報道。在之前報道的酵母菌生物強化處理高鹽廢水研究中，Meyerozyma作為酵母菌添加菌獲得了較好的強化處理效果，但在本研究只出現(xiàn)在R4中，占比為15.86%，這表明Candida更能適應(yīng)酸性高鹽環(huán)境，能在蜜餞廢水處理中成為優(yōu)勢菌株并發(fā)揮良好作用。
2.4 鹽度提高對微生物群落的影響
相較于pH改變造成的微生物群落結(jié)構(gòu)差異，鹽度提升對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響較小。由表1可知，當進水pH維持在4.0，鹽度從R4的3.5%升至R1的5.0%時，物種豐富度和多樣性都有所下降。
R1與R4共有細菌ASVs為46個，共有真菌ASVs為10個。基于Heatmap圖對屬水平上細菌和真菌群落結(jié)構(gòu)進行描述，結(jié)果見圖7。
從圖7可以看出，即使鹽度從3.5%升至5%，Pseudooceanicola（29.1%~38.8%）、Martelella（16.7%~12.7%）、Zunongwangia（10.7%~12.5%）在反應(yīng)器中仍然是優(yōu)勢菌屬，鹽度升高沒有影響主要優(yōu)勢菌屬的顯著變化。Martelella是耐鹽菌株，Wang等在3%鹽度下將Martelellasp.AD-3加入活性污泥中進行生物強化，獲得了優(yōu)異的多環(huán)芳烴降解性能。但在該實驗中，Martelella在鹽度提升后相對豐度下降，這可能是營養(yǎng)競爭的緣故。鹽度提升后，R1中Pseudooceanicola、Shewanella、Oceanobacillus、Celeribacter的相對豐度提升，表明這些菌株有較強的耐鹽性。此外，在R1和R4中，用于生物強化的Candida均占據(jù)優(yōu)勢地位，且提高鹽度后Candida的相對豐度顯著增加，由52.7%升至93.0%，這表明Candida可耐受5.0%鹽度并保持較高處理效率。
2.5 微生物群落與環(huán)境因子的相關(guān)性分析
如圖8所示，為了探究環(huán)境因子對微生物群落的影響，在微生物的屬水平上評價進水pH、鹽度、COD、TN與細菌微生物群落的相關(guān)性，通過方差膨脹因子（VIF）分析，篩選去除共線性較強（VIF>5）的環(huán)境因子，最終只保留pH和鹽度作為重要環(huán)境變量，用于后續(xù)的典范對應(yīng)性分析（CCA）。pH（r2=0.9342，p=0.009）及鹽度（r2=0.8834，p=0.05）與細菌群落結(jié)構(gòu)具有顯著相關(guān)性。此外，pH（r2=0.8594，p=0.009）與真菌群落結(jié)構(gòu)具有顯著相關(guān)性，而鹽度（r2=0.5765，p=0.141）與真菌群落結(jié)構(gòu)相關(guān)性較小。綜上，在蜜餞廢水處理中，pH與鹽度共同決定了反應(yīng)器的微生物群落結(jié)構(gòu)，但鹽度對真菌群落結(jié)構(gòu)影響較小。
在細菌群落中，R2的優(yōu)勢屬Acidovorax以及R3的優(yōu)勢屬Oceanobacillus、Vibrio與pH和鹽度呈負相關(guān)，R1與R4的優(yōu)勢屬Pseudooceanicola與pH和鹽度呈正相關(guān)。在真菌群落中，R2的優(yōu)勢屬Zygoascus與pH和鹽度呈負相關(guān)，而用于生物強化的Candida是R1、R3、R4的優(yōu)勢屬，與pH和鹽度呈正相關(guān)。以上結(jié)果表明，Candida具有良好的抗沖擊能力，能夠在酸性高鹽條件下良好生長，這對于提高生物系統(tǒng)的處理效率和運行穩(wěn)定性至關(guān)重要。
2.6 相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析
利用物種相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖，揭示酸性高鹽條件下主要微生物之間的共存情況及其相關(guān)性和變化規(guī)律，結(jié)果如圖9所示。生物相互作用是物種共生模式的主要驅(qū)動因素，在生物強化過程中，145個細菌屬之間和49個細菌屬之間分別呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)和負相關(guān)；28個真菌屬之間和2個真菌屬之間分別呈現(xiàn)顯著負相關(guān)和正相關(guān)。這些結(jié)果表明，在生物強化過程中，大多數(shù)細菌屬之間呈正相關(guān)，大多數(shù)真菌屬之間呈負相關(guān)。共生、互惠是正相關(guān)關(guān)系，而捕食、競爭等是負相關(guān)關(guān)系，通過微生物的復雜相互作用，可以實現(xiàn)對污染物的去除。
樞紐節(jié)點的類型和數(shù)量可以部分反映微生物群落結(jié)構(gòu)在特定環(huán)境中的穩(wěn)定性。在生物強化過程中，Oceanobacillus（細菌）與18個節(jié)點相連接，其中4個節(jié)點存在負相關(guān)關(guān)系，14個節(jié)點存在正相關(guān)關(guān)系，這表明該節(jié)點在細菌網(wǎng)絡(luò)中最為重要，相互關(guān)系最為強烈。Rhodotorula（真菌）與5個節(jié)點相連，表明該節(jié)點在真菌網(wǎng)絡(luò)中的相互關(guān)系最為強烈。另外，用于生物強化的Candida的節(jié)點連接度為1，與Kazachstania呈現(xiàn)負相關(guān)關(guān)系。研究表明，微生物可以通過協(xié)同作用或拮抗作用來適應(yīng)環(huán)境，并可能通過自身的代謝活動來去除污染物。此外，用于生物強化的Candida豐度最高，卻不是網(wǎng)絡(luò)中的高相關(guān)節(jié)點，其他大部分高相關(guān)節(jié)點也沒有出現(xiàn)在微生物群落的優(yōu)勢菌屬中，這與之前的研究一致。這表明Candida與本土菌群還沒有產(chǎn)生較強的合作競爭關(guān)系，因此填料的投加是有必要的，這有利于Candida保持優(yōu)勢地位以發(fā)揮作用。
3、結(jié)論
①投加Candida菌劑對SBBR進行生物強化，當處理鹽度為5.0%、初始pH為4.0的蜜餞廢水時，僅需10d即可實現(xiàn)高效、穩(wěn)定處理，反應(yīng)后pH可以提升至6.0，2d后COD去除率可達到73.4%。
②當鹽度為3.5%時，改變初始pH對反應(yīng)器處理效能產(chǎn)生顯著影響。運行10d后，R3（pH=3.3）和R4（pH=4.0）的各項污染物去除效果趨于穩(wěn)定，COD去除率分別為64.6%～68.7%、76.7%～79.6%，而R2（pH=2.6）的處理效果則略有波動，COD去除率為55.1%～64.6%，初始pH較高有利于提高污染物去除效率和出水pH。
③基因測序結(jié)果表明，在酸性高鹽條件下，投加的Candida菌劑表現(xiàn)出較強的耐受性和優(yōu)勢地位。在不同pH條件下微生物群落結(jié)構(gòu)會發(fā)生顯著變化。R1（pH=4.0，鹽度=5.0%）和R4（pH=4.0，鹽度=3.5%）優(yōu)勢屬均為Pseudooceanicola和Candida，R2（pH=2.6，鹽度=3.5%）的優(yōu)勢屬為Acidovorax和Zygoascus，R3（pH=3.3，鹽度=3.5%）的優(yōu)勢屬為Oceanobacillus、Vibrio和Candida。
④相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析揭示了微生物相互作用的復雜性，細菌主要呈現(xiàn)共生、互惠關(guān)系，真菌則主要呈現(xiàn)捕食、競爭關(guān)系。在生物強化過程中的細菌網(wǎng)絡(luò)中，Oceanobacillus表現(xiàn)為最重要的樞紐節(jié)點，而在真菌網(wǎng)絡(luò)中Rhodotorula則是最重要的樞紐節(jié)點。（來源：福州大學先進制造學院，自然資源部第三海洋研究所海洋生物遺傳資源重點實驗室）
