1 引言

　　生物在線預警是指利用生物體生理、生化或行為對水環(huán)境變化產(chǎn)生的反應信息，對水質(zhì)惡化趨勢的預測和突發(fā)事件的報警(Gerhardt et al., 2006).與其他生物監(jiān)測儀器相比較，以監(jiān)測魚類行為變化為基礎的水質(zhì)生物在線預警系統(tǒng)具有更好的穩(wěn)定性、可靠性、管理方便且運行費用低，是水源地、河流、污水處理廠等監(jiān)測水質(zhì)變化的最佳選擇(張金松等，2013).

　　環(huán)境中的污染物對幾乎所有的魚的行為都能夠產(chǎn)生影響，包括運動、繁殖、學習記憶能力、遷移、對掠食者的回避行為、捕食、社交等(Atchison et al., 1987).Ingram 等(2004)通過虹鱒魚的呼吸行為變化，如呼吸頻率和深度等，監(jiān)測某紙漿和造紙廢水的毒性.Kang等(2009)以污染物暴露后青鱂魚出現(xiàn)急速游動、浮頭行動等異常行為作為判斷水質(zhì)是否安全的依據(jù).趙曉艷等(2010)則利用非接觸類電場感應斑馬魚的活躍強度、呼吸頻率等可迅速檢測到水體中有機磷農(nóng)藥和抗生素的突發(fā)暴露.這些預警系統(tǒng)都是以1~2條魚為監(jiān)測單元，因在單獨空間內(nèi)其個體行為差異較大，使儀器的穩(wěn)定性能較低.和個體相比，當魚處在群體中時可互相溝通并傳導信息，擁有更大的感知范圍，并且受到污染物刺激后，魚群會通過回避、急速運動、集群等一系列行為的改變來維持體內(nèi)的穩(wěn)定應對環(huán)境的變化(Schlenk et al., 2001).Chew等(2009)改變以個體魚為觀察對象的方式，通過捕捉20條魚在魚缸中的分布和活動，考察魚群的活躍水平、軌跡曲線密度、回避行為以及魚群中的“社交互動”等來評價魚類對污染刺激的行為反應.Barry(2011)的研究表明，在一定濃度的化學藥品的刺激下魚除了有快速游動的反應外，魚群的軌跡分布也發(fā)生明顯的變化，魚群更傾向于貼壁運動，同時分形維數(shù)也在不斷減小.因此，選擇合理的指標，魚類群體行為變化的連續(xù)監(jiān)測，獲得更加全面的信息，可提高水質(zhì)在線監(jiān)測預警儀器的靈敏和穩(wěn)定性.

　　本研究改變以個體魚為觀察對象的方式，通過捕捉5條斑馬魚在魚缸中的分布和活動，考察魚群的游動速度、高度、平均距離、分散度和不同區(qū)域停留時間等6個指標，綜合游動行為、通訊行為和分布區(qū)域的變化，用更加全面的信息反應水質(zhì)突變狀況.實驗以正常水體中斑馬魚的群體行為變化為基礎，模擬氯氰菊酯和溴氰菊酯這兩種典型污染物質(zhì)突發(fā)性聯(lián)合脅迫下，斑馬魚的行為響應來驗證監(jiān)測指標選取的合理和有效性.

　　2 實驗材料和方法

　　2.1 斑馬魚的培養(yǎng)

　　實驗采用的斑馬魚(Zebrafish，Danio rerio)是國際標準化組織(ISO)推薦的標準實驗生物之一，在環(huán)境毒性評價的相關研究中應用廣泛.本實驗室對斑馬魚的飼養(yǎng)繁殖采用流水式，養(yǎng)殖用水為脫氯自來水，水溫為(28±1)℃，溶解氧為(6.5±0.2)mg · L-1，光照周期為10 h：14 h，以豐年蝦為食，每天投食2～3次.實驗時挑選魚齡為6~8個月，體長為(30±2)mm的斑馬魚，每組實驗用魚5條，雌雄比例為3：2，實驗前24 h不喂食.

　　2.2 實驗設計

　　2.2.1 斑馬魚急性毒性實驗

　　參照國際標準 ISO 7346 1-3《物質(zhì)對淡水魚(斑馬魚)急性致死毒性的測定》，以1.5 g(魚)· L-1的要求，設置6個濃度梯度，每個濃度設3個平行，每組放10尾斑馬魚.實驗開始后第0、8、12、24 h觀察并記錄各容器實驗魚的存活情況.用鑷子夾魚的尾部，如無反應，即認為魚已經(jīng)死亡，發(fā)現(xiàn)死魚后及時撈出.利用Graphpad Prism 5.0擬合劑量-效應曲線并計算得出24 h半致死濃度(LC50-24h).

　　2.2.2 斑馬魚魚群行為變化實驗

　　采用水質(zhì)毒性在線檢測儀(RTB，深圳水務(集團)有限公司研制)進行斑馬魚的個體和群體行為變化的定量監(jiān)測，如圖 1所示.在一個尺寸為400 mm×75 mm×300 mm的測試箱前設置一個CCD攝像頭，利用攝像追蹤系統(tǒng)和圖像分析技術，通過識別每條魚的特征輪廓來確定斑馬魚的運動方向與位置，并以12~16幀每秒的速度記錄標志點坐標通過軟件轉(zhuǎn)換計算出魚群的運動行為參數(shù)，包括游動行為(速度和高度)、通訊行為(平均距離和分散度)和區(qū)域分布情況(各區(qū)域停留時間占總時間的比例)，各指標定義如表 1所示.

　　圖 1 測量斑馬魚行為變化的實驗裝置設計圖

表1 監(jiān)測指標的解析

　　實驗用水采用半靜態(tài)式流水實驗，控制進水流速為1 L · h-1，水溫為25 ℃，光照恒定，盡量減少人為、噪音等非水質(zhì)因素的干擾.實驗共計運行3 h.其中，前1 h為空白實驗，記錄該組斑馬魚在正常水質(zhì)狀況下的各監(jiān)測指標的變化范圍，從第2 h開始時，即第60 min時加入化學物質(zhì)，模擬實際水體突發(fā)性污染事件，記錄斑馬魚的行為變化.每組實驗的行為數(shù)據(jù)由5條魚的平均數(shù)求得，每個質(zhì)量濃度進行3組平行，結(jié)果以3組平行實驗組的平均值顯示.

　　3 結(jié)果

　　3.1 急性毒性實驗

　　氯氰菊酯和溴氰菊酯對斑馬魚的24 h半致死濃度如表 2所示.結(jié)果表明，溴氰菊酯和氯氰菊酯對斑馬魚的LC50-24h分別為13.75×10-3 mg · L-1和69.61×10-3 mg · L-1，對斑馬魚的毒性大小為溴氰菊酯>氯氰菊酯.本研究以LC50-24h為1個毒性單位(1 TU)，在兩種化合物在各自0.25 TU(氯氰菊酯3.75 μg · L-1和溴氰菊酯15 μg · L-1)的聯(lián)合暴露下觀察斑馬魚的行為變化規(guī)律.

表2 氯氰菊酯和溴氰菊酯對斑馬魚的24 h急性毒性

　　3.2 斑馬魚游動行為的變化

　　如圖 2所示，第1 h正常水體暴露時，無外界刺激的干擾，斑馬魚的行為強度變化穩(wěn)定，游動速度主要在30~60 mm · s-1之間均勻波動，平均速度為46.52 mm · s-1，標準差為9.08 mm · s-1;而高度在50~200 mm之間均勻波動，第1 h的平均高度值為124.60 mm，標準差為39.85 mm，如表 3所示.

　　圖 2 突發(fā)污染暴露下斑馬魚群體游動行為的變化

　　接觸到污染物的斑馬魚興奮異常，速度在30 min內(nèi)持續(xù)增大，變化范圍明顯高于暴露前水平，在60~85 mm · s-1的范圍內(nèi)波動，最大速度高達84.25 mm · s-1.隨后急劇下降，在15 min內(nèi)降低至暴露前均值的42%左右，速度分布的標準偏差也是暴露前2倍，如表 3.最終速度維持在10~30 mm · s-1的水平并在后續(xù)的暴露中都維持在這一范圍內(nèi)變化.而高度的變化稍微滯后于速度的突變，在暴露12 min后才明顯增高，并在持續(xù)的20 min內(nèi)均值都高于200 mm，隨著暴露時間的增長，高度又逐漸恢復，第2 h的均值大小和暴露前相當，但標準偏差較大，即數(shù)據(jù)波動大.

表3 暴露前后斑馬魚游動行為數(shù)值分析

　　3.3 斑馬魚通訊行為的變化

　　受到污染物刺激后的魚群明顯失去原有的群體性，在剛接觸到污染物的10 min內(nèi)有明顯的集群現(xiàn)象，平均距離和分散度短暫下降，然后又逐漸增大.魚群分布在暴露1 h后與暴露前差異顯著，平均距離均值從暴露前124 mm增加到178 mm，即增大43.5%，而分散度均值也由暴露前10%增加到22%，增大120%，如表 3所示.在第2 h的暴露中，平均距離和分散度的變化又有緩慢恢復至暴露前水平的趨勢，均值迅速下降，但標準差仍呈增大趨勢，即數(shù)據(jù)波動變大，如圖 3所示.

　　圖 3 突發(fā)污染暴露下斑馬魚社交行為的變化

　　3.4 斑馬魚的運動區(qū)域的分布

　　從圖 4明顯可以看出，正常水體中，斑馬魚的運動軌跡均勻分布在整個魚箱中，污染物暴露后，魚的活動范圍明顯減小，有逃離監(jiān)測箱左下角(進水口)在右上角(出口處)游動的趨勢.為了更好的研 究魚的逃避行為，將這一趨勢進行量化，把魚箱等分為五行五列，分別統(tǒng)計每5 min內(nèi)斑馬魚在每一區(qū)域的停留時間占總時間的比率，結(jié)果如圖 5所示.暴露前1 h斑馬魚在各區(qū)域內(nèi)的分布基本穩(wěn)定，其中在列1和行5區(qū)域內(nèi)停留時間較多，為27%和25%左右，隨著暴露時間的延長，這兩個區(qū)域的停留時間逐漸縮短，而列5和行1內(nèi)有明顯的增加趨勢，都增至25%左右.

　　圖 4 斑馬魚的魚群運動軌跡圖(a. 第30 min，b. 第90 min)

　　圖 5 斑馬魚暴露前后運動區(qū)域的分布

　　4 討論

　　正常水體在監(jiān)測期間水質(zhì)保持一致，因無外來刺激的干擾，斑馬魚魚群的行為變化穩(wěn)定，游動速度、高度、平均距離和分散度等指標都在均值上下穩(wěn)定波動，運動軌跡在檢測箱中均勻分布.由此可知，斑馬魚的游動行為在正常的水質(zhì)狀況下呈現(xiàn)明顯的規(guī)律性，可用于水質(zhì)突變條件下斑馬魚的行為比較，具有一定的可靠性.Gerhardt等(2002)證明在一定的水體環(huán)境下，利用不同頻率信號記錄的生物的游動、爬行、行走和呼吸等運動行為參數(shù)都在一個穩(wěn)定范圍內(nèi)變化.斑馬魚就被應用于該儀器中，空白暴露時穩(wěn)定的行為變化趨勢為后續(xù)污染物暴露的反應提供了可靠的參照(趙曉艷等，2010).

　　利用對化學刺激品敏銳的感覺器官，斑馬魚可感知水體突變的狀況，表現(xiàn)出慌亂不安的過度活躍(Graham et al., 2004).游動速度在暴露過程中變化最為敏感和劇烈，前30 min內(nèi)持續(xù)增大，變化區(qū)間由暴露前30~60 mm · s-1變化到60~85 mm · s-1.這種急速運動被稱為“回避反應”，是魚對水環(huán)境污染所產(chǎn)生的第一層次行為變化，其表現(xiàn)形式和所維持的時間長短受暴露化合物的種類及濃度的影響(任宗明等，2008).斑馬魚通過行為機制逐漸適應污染環(huán)境而導致的行為的變化，但隨著暴露時間的增長，污染物逐漸在斑馬魚體內(nèi)積累，毒性最終爆發(fā).暴露30 min后，斑馬魚的游動速度急劇下降.有研究表明，溴氰菊酯具有很強的神經(jīng)毒性，可通過抑制腦突觸體膜上的ATP酶，使突觸后膜上的乙酰膽堿酯酶(AchE)等神經(jīng)遞質(zhì)大量聚集，從而引起腦AchE被抑制，而氯氰菊酯的暴露則可使魚體內(nèi)產(chǎn)生大量的氧元素O2-，以致SOD酶活性被抑制，導致鰓、肝等組織的損傷(Soderlund et al., 2002).污染物對斑馬魚生理及組織等的影響導致其游泳速度最終維持在10~30 mm · s-1之間，僅是暴露前的1/2倍.

　　速度突然增大是魚類對環(huán)境變化刺激的第一反應，其次才是咳嗽頻率等呼吸行為的改變(Gerhardt et al., 2005).Kang等(2009)以“急速運動”和“浮頭行動”作為衡量青鱂魚運動異常的重要指標，指出污染物質(zhì)對魚呼吸系統(tǒng)阻礙可導致游動深度的變化.但是，對呼吸系統(tǒng)的損傷要有一個毒物累積的過程，所以高度的反應會滯后于速度的變化.從魚群高度的變化可知，暴露12 min后游動高度明顯的增大，由暴露前的50~200 mm變化到150~270 mm.隨著暴露時間的延長，斑馬魚不斷通過自身的生理和行為調(diào)節(jié)適應了外界環(huán)境的壓力，游動高度在第2 h內(nèi)逐漸恢復至暴露前水平，但標準差仍然繼續(xù)增大，即斑馬魚不斷調(diào)節(jié)適應的過程中行為的穩(wěn)定性變差.具體參見污水寶商城資料或http://www.xhxdt.com更多相關技術文檔。

　　受到環(huán)境污染的刺激，魚類會在驚恐慌亂或靜止某個角落的狀態(tài)下使魚群失去原有的分布和通訊行為.接觸到污染物的前10 min內(nèi)平均距離和分散度迅速下降，魚群出現(xiàn)短暫的集群現(xiàn)象.黃東龍等(2001)實證在鉛、鎘等重金屬的暴露下，斑馬魚在短時間內(nèi)發(fā)生明顯的群聚性行為.這種行為也是一種對外界壓力的回避行為.隨著接觸時間的增長，魚群變得松散，群體性游動現(xiàn)象減弱，平均距離和分散度的波動區(qū)間明顯高于暴露前水平，分散度甚至為暴露前的2倍.Chew等(2009)證明在氯的刺激下，斑馬魚魚群失去原有的運動、分布和社交規(guī)律.進一步研究中還要再增加一些如平衡損失率、不規(guī)則轉(zhuǎn)彎等個體異常的監(jiān)測指標，這樣個體和群體變化相結(jié)合，以獲得更加全面的信息.

　　隨著暴露時間的增長，斑馬魚不斷通過行為、代謝調(diào)節(jié)等適應環(huán)境的變化，游動高度、平均距離和分散度等逐漸恢復至暴露前水平，但仍選擇在濃度相對較低、接近水面的出水口附近游動.感知到水體中污染物的存在后，魚會往無污染或污染程度較輕的區(qū)域逃避(Clingerman et al., 2007).Gullick等(2003)使裝置形成不同的污染物濃度梯度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)魚的大部分時間集中在潔凈水一端.雖然水箱中的水力流態(tài)是自下向上但進水口處的濃度還是高于出水處，魚可感知這些區(qū)域的差異，逃離濃度較高的列1和2的區(qū)域在行1和行2的停留時間明顯增加.

　　5 結(jié)論

　　斑馬魚是一種群游魚類，在水體中連續(xù)不斷的游動且可互相溝通，和個體相比集群之后能快速獲得更大的感知范圍，快速傳導信息，為水質(zhì)在線預警提供更加全面、有效的信息.在溴氰菊酯和氯氰菊酯的聯(lián)合暴露的刺激下，斑馬魚的表現(xiàn)出快速不安的急速游動，速度由暴露前30~60 mm · s-1增至60~85 mm · s-1，而高度的變化滯后于速度12 min左右.在活動強度發(fā)生改變的同時，斑馬魚魚群的分散度和平均距離也不斷增大，分別增大43.6%和120.0%.但隨著暴露時間的增長，污染物也不斷在體內(nèi)積累，最終導致游泳速度明顯下降且在污染濃度較低的區(qū)域停留時間增長，而高度、平均距離和分散度逐漸恢復至暴露前水平，但波動較大.利用速度、高度、平均距離、分散度、不同區(qū)域停留時間等6項可完整的描述這一過程的變化，全面及時的獲得魚群受污染物影響的行為變化特征，是用于水質(zhì)預警的可靠指標.后續(xù)的研究應該考察斑馬魚魚群對其他污染物的行為反應，并通過計算和比較各指標權重和參與運算的方式，確定一個能夠綜合評價水質(zhì)變化程度的參數(shù).