畜禽養(yǎng)殖污染已經(jīng)成為農(nóng)業(yè)面源污染的主要來源。其中，畜禽養(yǎng)殖廢水屬于ρ(SS)、ρ(CODCr)和ρ(NH4+-N)“三高”的有機廢水，由于其處理成本高，處理難度大，大量未經(jīng)處理的畜禽養(yǎng)殖廢水直接排放，對農(nóng)村生態(tài)和環(huán)境造成嚴重破壞。如何高效處理該類廢水，已成為制約畜禽養(yǎng)殖業(yè)綠色生態(tài)發(fā)展的瓶頸。對于規(guī)模化畜禽養(yǎng)殖廢水，目前國內(nèi)外采用的成熟處理工藝主要是厭氧-好氧聯(lián)合或厭氧-自然處理聯(lián)合工藝，養(yǎng)殖廢水經(jīng)過厭氧發(fā)酵處理后，雖然大部分CODCr被去除，但NH4+-N只是形態(tài)發(fā)生變化，濃度仍然很高，造成了低碳高氮沼液的產(chǎn)生，導致C∕N嚴重失調(diào)，脫氮效果差。好氧工藝發(fā)展已經(jīng)成熟，但其在處理沼液時由于微生物耐高ρ(NH4+-N)性能差、碳源不足而導致后續(xù)工藝流程復雜、處理成本高和脫氮效果差等實際問題，鑒于此，該研究提出基于異養(yǎng)硝化-好氧反硝化脫氮技術(簡稱“HN-AD技術”)的新型脫氮工藝。
HN-AD技術通過易培養(yǎng)的異養(yǎng)型單一菌種HN-AD菌(異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌)使得異養(yǎng)硝化和好氧反硝化在好氧條件下同時進行，實現(xiàn)CODCr、NH4+-N、NO2--N和NO3--N的同步有效去除。與現(xiàn)有的一些傳統(tǒng)及新型脫氮技術相比，其具有生長速率快、培養(yǎng)周期短、極端環(huán)境耐受性能強、運行條件單一、運維控制簡單、適應范圍廣、處理效率高等優(yōu)點，因此更適用于養(yǎng)豬廢水處理。但目前該技術的研究主要集中在HN-AD菌的分離篩選、鑒定及性能驗證等方面，而關于該菌工程應用方面的研究卻鮮見報道，同時，HN-AD菌在自然環(huán)境中數(shù)量少、功能單一以及難以在傳統(tǒng)處理系統(tǒng)中富集等問題進一步限制了HN-AD技術的應用。
針對上述問題，該研究采用前期篩選出的兼具高ρ(NH4+-N)耐受性和高脫氮效率的HN-AD菌對生物轉(zhuǎn)盤工藝進行生物強化，重點考察了強化污泥掛膜和菌劑掛膜兩種不同生物強化方式對該工藝啟動時間、碳耗、能耗及其對真實畜禽養(yǎng)殖廢水處理效果的影響，并分別采用SEM(掃描電鏡)和IlluminaMiSeq測序技術分析對比了生物膜表面微觀形態(tài)和生物膜中微生物多樣性的差異，以期為HN-AD技術的工程化應用提供理論及實踐基礎。
1、材料與方法
1.1 試驗裝置
如圖1所示，強化污泥掛膜和菌劑掛膜反應器均采用相同的試驗裝置，反應器所用盤片(3D-RBC)由重慶川儀環(huán)境科技有限公司提供，反應器池體由厚度5mm的有機玻璃構成，有效體積18.5L，盤片分為4級，每級盤片直徑為30cm，厚7cm，材質(zhì)為聚丙烯，浸沒率為40%，反應器由低速電機啟動。
1.2 試驗用水
如表1所示，試驗用水采用自來水配置，均以無水乙酸鈉為碳源，以硫酸銨為氮源，以磷酸氫二鉀為磷源，同時添加微量元素以保證反應器內(nèi)細菌的正常生長，每升配水添加5mL微量元素，微量元素成分為MgSO4•7H2O2g∕L，MnSO4•H2O0.1g∕L，CaCl21.5g∕L，FeSO4•7H2O0.1g∕L。
1.3 研究方法
試驗過程分為3個階段，即掛膜啟動階段、參數(shù)優(yōu)化階段、處理真實廢水階段。
第Ⅰ階段，掛膜啟動階段。條件控制在溫度為25~30℃，盤片線速度為7.5m∕min，HRT(水力停留時間)為24h，ρ(DO)為3mg∕L，pH范圍為7.5~8.0。菌劑掛膜方式:前1~15d為序批式運行，第1天向生物轉(zhuǎn)盤反應器中接種OD600nm(表征菌液濃度的吸光度值)為1.2的HN-AD菌液18.5L，分別在第2、6、11、15天間歇補加5%有效體積菌液的方式實現(xiàn)掛膜，菌液ρ(NH4+-N)為500mg∕L，期間檢測NH4+-N去除率及OD600nm的變化;第16~19天為連續(xù)流穩(wěn)定運行，條件保持不變。強化污泥掛膜方式:向反應器中接種活性污泥18.5L，前2d進行悶曝;第3天開始改成連續(xù)流運行，并按梯度增大進水濃度，第3、9、15、23天進水ρ(NH4+-N)梯度分別為50、100、300、450mg∕L;第24~33天進行生物強化，每天接種5%有效體積HN-AD菌液，菌液OD600nm為1.2，進水ρ(NH4+-N)保持在500~600mg∕L，檢測強化期間ρ(NH4+-N)變化。
第Ⅱ階段，參數(shù)優(yōu)化階段。條件控制在溫度為25~30℃，HRT為24h，pH范圍為7.5~8.0。兩個反應器均采用連續(xù)方式運行，探究在不同C∕N(5、8、10)、線速度(5.0、7.5、15.0m∕min)參數(shù)下該工藝的處理效果。
第Ⅲ階段，處理真實廢水階段。條件控制在溫度為25~30℃，HRT為24h，ρ(DO)為4mg∕L，pH范圍為7.5~8.0。對比分析二者最優(yōu)工況(C∕N為10，線速度為15.0m∕min)下真實畜禽養(yǎng)殖廢水的處理效果。分別選擇菌劑掛膜反應器、強化污泥掛膜反應器的掛膜完成時期、運行時期在不同盤片上選取生物膜，分別標記為A、B、C、D樣品，于-80℃下保存1h后提取DNA后進行微生物多樣性分析，另取兩個反應器掛膜后的盤片樣，于-4℃下保存1h后脫水預處理，并分別進行SEM鏡檢。
1.4 分析項目及方法
水樣經(jīng)過4μm膜片過濾后，ρ(DO)采用HQ-30d便攜式溶解氧測定儀測定，ρ(CODCr)采用快速消解分光光度法測定，ρ(TN)采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法測定，ρ(NH4+-N)采用納氏試劑分光光度法測定，OD600nm采用紫外分光光度法測定。SEM分析先冷凍干燥做脫水預處理，由武漢鑠思百檢測技術有限公司進行TESCANMIRA3熱場發(fā)射掃描電鏡觀察生物膜表面微觀形態(tài)結構。DNA提取和高通量測序采用購自天根生化科技(北京)有限公司的Mobio PowerSoil DNA Isolation Kit提取固定化菌液總基因組DNA。Miseq平臺對16SrRNA基因高變區(qū)序列進行測序，測序區(qū)域選擇V3+V4區(qū)，測序片段為468bp，測序引物為338F-806R，使用Trimmomatic、FLASH軟件對Miseq測序數(shù)據(jù)進行處理獲得干凈數(shù)據(jù)，在Usearch軟件平臺中使用uparse方法將序列按照彼此相似性為97%劃分為許多小組，一個小組為一個OTU(operational taxonomic units)，從而得到OTU的代表序列。然后，使用uchime檢測PCR擴增中產(chǎn)生的嵌合體序列并從OTU中去除，再用usearch_global方法將優(yōu)化序列map比對回OTU代表序列，最終得到OTU各樣品序列豐度統(tǒng)計表。
2、結果與討論
2.1 掛膜啟動階段脫氮效果對比分析
在掛膜階段，主要檢測項目為ρ(NH4+-N)、OD600nm，運行條件均為HRT24h、線速度7.5m∕min、ρ(DO)3mg∕L、pH范圍7.5~8.0。不同反應器的脫氮效果如圖2所示，在強化污泥掛膜的反應器〔見圖2(a)〕中，污泥掛膜處理性能較低，故前期進水ρ(NH4+-N)低于100mg∕L，后期增至500mg∕L以上，與菌劑掛膜反應器中進水ρ(NH4+-N)一致，可分為兩個階段。
第1階段(1~23d):污泥掛膜階段。該階段進水ρ(NH4+-N)低，為65.86mg∕L，前期(1~8d)脫氮效率可達81.11%。生物膜層逐漸加厚，后期(9~23d)將進水ρ(NH4+-N)緩慢升至400mg∕L以上，NH4+-N去除率降至69.24%。
第2階段(24~33d):生物強化運行階段。利用HN-AD菌對其進行強化，在第24天對反應器每天接種5%有效體積的菌液，OD600nm為1.2，當進水ρ(NH4+-N)升至500mg∕L以上時，NH4+-N的去除率可達73.10%。
菌劑掛膜的反應器〔見圖2(b)〕，在掛膜期間進水ρ(NH4+-N)為500mg∕L左右，可以分為兩個階段。
第1階段(1~15d)，菌劑掛膜階段。前期(1~6d)ρ(NH4+-N)下降較快，去除率達85.89%。反應器中菌液OD600nm值快速減小。后期(7~15d)生物膜厚度逐漸增加，NH4+-N去除率在90%以上。此時生物轉(zhuǎn)盤上明顯附著一層黃色的生物膜，同時鏡檢發(fā)現(xiàn)生物膜表面存在很多桿狀和球形狀原生動物。
第2階段(16~19d):穩(wěn)定運行階段。進水ρ(NH4+-N)在500mg∕L以上時，去除率為94.37%。
綜上，菌劑掛膜反應器啟動所需時間為19d，強化污泥掛膜反應器啟動所需時間為33d，與馮迪等結論相似，前者較后者時間縮短1∕3左右，可能是HN-AD菌因其高耐受性的特點，較普通微生物更易富集、生長速度更快。污泥掛膜反應器在前期的脫氮效果差，強化后的脫氮效果明顯提高，但仍低于菌劑掛膜反應器，可能是強化污泥掛膜的掛膜方式富集了部分HN-AD菌，因此效果得以提升，但相較而言，菌劑掛膜所形成的生物膜中HN-AD功能菌富集程度更高，因此脫氮效果更好。
2.2 參數(shù)優(yōu)化階段處理效果對比分析
2.2.1 不同線速度對有機物去除及脫氮性能的影響
不同線速度下兩個反應器的處理效果如圖3所示，此過程C∕N為5、HRT為24h、pH范圍為7.5~8.0。根據(jù)線速度大小可將此過程分為3個階段進行對比分析。
第1階段(線速度為5.0m∕min)ρ(DO)為2mg∕L，強化污泥掛膜反應器〔見圖3(a)〕進水ρ(CODCr)為2106.12mg∕L，ρ(NH4+-N)為503.46mg∕L，此條件下ρ(DO)較低，盤片上的微生物生長緩慢，CODCr、NH4+-N、TN去除率較低，分別為61.14%、70.62%、63.41%。菌劑掛膜反應器〔見圖3(b)〕進水ρ(CODCr)為2521.55mg∕L，ρ(NH4+-N)為547.28mg∕L，主要依靠盤片上富集的HN-AD菌對污水進行處理，CODCr、NH4+-N、TN去除率分別為70.41%、71.85%、66.00%。
第2階段(線速度為7.5m∕min)ρ(DO)為3mg∕L，強化污泥掛膜反應器進水ρ(CODCr)為2339.81mg∕L，ρ(NH4+-N)為504.24mg∕L，由于線速度增大，反應器的復氧能力得以提升，CODCr、NH4+-N、TN去除率分別升至63.07%、72.27%、68.90%。菌劑掛膜反應器進水ρ(CODCr)為2494.60mg∕L，ρ(NH4+-N)為507.75mg∕L，HN-AD菌在好氧條件下優(yōu)勢更加顯著，CODCr、NH4+-N去除率分別升至73.80%、77.63%，TN去除率基本未變。
第3階段(線速度為15.0m∕min)ρ(DO)為4mg∕L，強化污泥掛膜反應器進水ρ(CODCr)為2356.93mg∕L，ρ(NH4+-N)為529.56mg∕L，反應器在此線速度下對污水的處理效果依舊呈上升趨勢，CODCr、NH4+-N去除率分別升至65.52%、79.75%，TN去除率為61.47%。菌劑掛膜反應器進水ρ(CODCr)為2556.64mg∕L，ρ(NH4+-N)為500.34mg∕L，線速度增大對HN-AD菌的去污能力提升顯著，此時CODCr、NH4+-N去除率分別為83.71%、71.50%，TN去除率與上一階段相差不大，為65.16%。
由圖3可見，強化污泥掛膜反應器在線速度為7.5m∕min時的處理效果與菌劑掛膜反應器在線速度為5.0m∕min時的脫氮效果大致相當，但后者在工程應用時轉(zhuǎn)速較前者降低了33.33%，更節(jié)省能耗，運維成本更低，可能是后者采用的生物強化方式富集的HN-AD菌更多，在參數(shù)優(yōu)化階段富集程度依舊保持穩(wěn)定，因而效果更好。隨著線速度增大，強化污泥掛膜和菌劑掛膜反應器去污能力增強，菌劑掛膜反應器特別顯著，但TN去除率一直變化不大，可能是線速度對NO3--N去除率影響較小。線速度與DO的傳質(zhì)速率有關，結果表明強化污泥掛膜和菌劑掛膜反應器的處理效果隨線速度增大均呈現(xiàn)上升趨勢，可能是ρ(DO)升高的原因，也可以說明在線速度為15.0m∕min時反應器中的ρ(DO)仍未達到過飽和狀態(tài)，繼續(xù)提升轉(zhuǎn)速可能會加強反應器的NH4+-N去除效果，但運行成本也會增加。線速度為15.0m∕min時，強化污泥掛膜和菌劑掛膜反應器的處理效果均最佳，與李芳等結論相似。
2.2.2 不同C∕N對有機物去除及脫氮性能的影響
不同C∕N下強化污泥掛膜和菌劑掛膜反應器的處理效果如圖4所示，該過程在一定的進水有機負荷范圍〔以ρ(CODCr)計，≤0.25kg∕(m3•d)〕內(nèi)，提高ρ(CODCr)可以提升微生物的活性和利用率，進而增強處理效果。在該階段可以逐漸提升C∕N，保持HRT為24h，線速度為15.0m∕min，ρ(DO)為4mg∕L，pH范圍為7.5~8.0，可分為3個階段進行對比分析。
第1階段C∕N為5，強化污泥掛膜反應器〔見圖4(a)〕進水ρ(CODCr)為2562.26mg∕L，ρ(NH4+-N)為520.39mg∕L，此階段進水ρ(CODCr)較線速度優(yōu)化第3階段略高，CODCr去除率降至50.24%，NH4+-N、TN去除率基本未變，分別為74.54%、62.42%。菌劑掛膜反應器〔見圖4(b)〕在此階段進水ρ(CODCr)為2647.54mg∕L，ρ(NH4+-N)為496.73mg∕L，菌劑掛膜反應器較強化污泥掛膜反應器處理效果更穩(wěn)定，CODCr、NH4+-N、TN去除率分別為86.11%、70.51%、66.91%。
第2階段C∕N為8，強化污泥掛膜反應器進水ρ(CODCr)為4095.61mg∕L，ρ(NH4+-N)為556.09mg∕L，隨有機物濃度增大，處理效果有所上升，CODCr、NH4+-N、TN去除率分別為58.13%、74.70%、60.85%。菌劑掛膜反應器在此階段進水ρ(CODCr)升至4188.33mg∕L，ρ(NH4+-N)為518.30mg∕L，總的處理效果比上一階段優(yōu)勢明顯，CODCr去除率略有降低，為77.28%，NH4+-N、TN去除率分別升至91.06%、73.28%。
第3階段C∕N為10，強化污泥掛膜反應器進水ρ(CODCr)為5113.21mg∕L，ρ(NH4+-N)為564.88mg∕L，CODCr、NH4+-N、TN去除率分別升至63.13%、78.41%、59.93%。菌劑掛膜反應器在此階段進水ρ(CODCr)升至5146.59mg∕L，ρ(NH4+-N)為528.75mg∕L，CODCr和NH4+-N去除率均較上一階段有所升高，分別達84.75%、95.25%，TN去除率變化不大。
由圖4可見，強化污泥掛膜反應器在C∕N為10時的處理效果與菌劑掛膜反應器在C∕N為5時的處理效果大致相同，但后者較前者碳源消耗降低48.22%，更節(jié)省碳耗，且在C∕N優(yōu)化的各階段，菌劑掛膜反應器脫氮效果均優(yōu)于強化污泥掛膜反應器，推測是前者掛膜方式富集的HN-AD菌更多，經(jīng)線速度優(yōu)化后，富集程度依舊更高;C∕N為5時，進水ρ(CODCr)變化使得強化污泥掛膜反應器的CODCr去除效果較線速度優(yōu)化第3階段有所降低，而菌劑掛膜反應器未有顯著變化，說明后者穩(wěn)定性更好，HN-AD菌更耐受沖擊負荷;前者在C∕N為8時，CODCr去除率較第1階段和第3階段分別低10.25%、8.81%，可能是在C∕N為5時HN-AD功能菌較少，與其他微生物菌群共同作用，C∕N為8時受到高濃度有機負荷沖擊，耐受性低的微生物菌群受到抑制，導致其去除率降低，HN-AD功能菌耐高C∕N特性優(yōu)勢顯著，隨著C∕N增大，富集程度增大，因而C∕N為10時去除率上升;此外，隨著C∕N的升高，強化污泥掛膜和菌劑掛膜反應器的CODCr、NH4+-N、TN去除率大致都隨之升高，可見C∕N為10即為最佳運行條件，與何環(huán)等結論相似。
2.3 處理真實廢水階段效果對比分析
參數(shù)優(yōu)化后，在線速度為15.0m∕min，C∕N為10，HRT為24h，ρ(DO)為4mg∕L下，探究強化污泥掛膜和菌劑掛膜反應器對真實畜禽養(yǎng)殖廢水的處理效果(見表2)。由表2可見:菌劑掛膜的反應器真實廢水進水ρ(CODCr)、ρ(NH4+-N)、ρ(TN)分別為7773.08、647.88和790.26mg∕L，該反應器對真實廢水CODCr、NH4+-N、TN的平均去除率分別為68.95%、87.24%和79.45%;強化污泥掛膜反應器真實廢水進水ρ(CODCr)、ρ(NH4+-N)、ρ(TN)分別為7437.92、695.02、719.18mg∕L，該反應器對真實廢水CODCr、NH4+-N、TN的平均去除率分別為64.37%、68.71%、61.52%。經(jīng)過對比可見:菌劑掛膜反應器較強化污泥掛膜反應器CODCr、NH4+-N、TN去除率分別高出7.11%、26.97%、29.14%，前者去除效果更好;強化污泥掛膜和菌劑掛膜反應器CODCr去除率均低于70%，處理效果低于模擬廢水試驗，推測是真實廢水有機負荷更高，且存在較多的SS、抗生素等成分，使得HN-AD菌生長受到影響，導致CODCr去除率降低。
2.4 不同掛膜方式的反應器微生物群落結構變化對比分析
掛膜完成時期以及穩(wěn)定運行時期的微生物群落結構變化如圖5所示。由圖5可見，強化污泥掛膜和菌劑掛膜反應器內(nèi)的HN-AD脫氮優(yōu)勢菌屬的種類及相對豐度均發(fā)生了變化。菌劑掛膜的反應器中，掛膜時期的Flavobacterium、Acinetobacter(不動桿菌屬)相對豐度從19.18%、11.36%分別變?yōu)?/span>0.27%、0.14%，相對豐度均快速降低;運行后，Diaphorobacter、Comamonas的相對豐度從0.06%、0.09%分別增至2.16%、2.99%。該反應器中的優(yōu)勢菌群由Acinetobacter變?yōu)?/span>Comamonas，以進行異養(yǎng)硝化好氧反硝化。
污泥掛膜的反應器中，掛膜時期的Hydrogenophaga(嗜氫菌屬)、Diaphorobacter相對豐度從1.08%、0.65%分別降至0.70%、0.55%。對該反應器進行生物強化后，Flavobacterium、Rhizobium的相對豐度也迅速降低，Acinetobacter、Comamonas的相對豐度分別迅速增至18.56%、0.29%。該反應器接種菌劑前后的菌群不僅豐度發(fā)生了變化，其優(yōu)勢種群也發(fā)生了變化，變化為Acinetobacter，并出現(xiàn)了新的HN-AD功能優(yōu)勢菌屬。對比二者的微生物多樣性可見，強化污泥掛膜和菌劑掛膜反應器中Hydrogenophaga和Flavobacterium均呈現(xiàn)豐度降低的趨勢，可能是該菌屬對高ρ(NH4+-N)耐受性低，對脫氮過程起到的作用小。雖然強化污泥掛膜的反應器中Acinetobacter相對豐度遠高于菌劑掛膜反應器，但菌劑掛膜反應器中的Comamonas是強化污泥掛膜反應器的10倍左右，結合處理效果對比分析，可以推測Comamonas是在異養(yǎng)硝化好氧反硝化過程中發(fā)揮關鍵作用的菌屬。
2.5 不同掛膜方式的反應器SEM表征分析
圖6為生物盤片序批式接種掛膜的SEM對比結果。在盤片掛膜前〔見圖6(a)〕的SEM圖片中可以觀察到生物盤片表面為規(guī)則的波紋狀，這種結構有利于增加盤片表面積、增加生物附著量。在強化污泥掛膜后〔見圖6(b)〕，盤片表面附著了大量的污泥，生物膜呈三維交織狀，膜層較厚。在菌劑掛膜后〔見圖6(c)〕，盤片表面可形成較為平滑的生物膜，膜層較薄，呈簇團狀的球狀菌群緊密附著在生物膜上，其菌劑附著量較強化污泥掛膜更多。結合微生物多樣性分析可以得出，菌劑掛膜的盤片吸附的HN-AD優(yōu)勢菌以Comamonas、Diaphorobacter為主，強化污泥掛膜盤片表面附著的球狀菌為HN-AD優(yōu)勢菌，以Comamonas、Acinetobacter為主;對比生物膜可以看出，膜層較薄時菌劑吸附更多、傳質(zhì)速率更高、處理效果更好。
3、結論
a)菌劑掛膜啟動所需的時間(19d)明顯少于強化污泥掛膜(33d)。
b)參數(shù)優(yōu)化階段，在C∕N為10、線速度為15.0m∕min時的去除效果最好;同等處理效果下，菌劑掛膜反應器的碳耗、能耗較強化污泥掛膜反應器分別少48.22%、33.33%。
c)真實廢水處理階段，菌劑掛膜反應器ρ(CODCr)、ρ(NH4+-N)、ρ(TN)的去除率分別為68.95%、87.24%和79.45%，較強化污泥掛膜反應器分別高出7.11%、26.97%、29.14%。
d)菌劑掛膜反應器中Comamonas是強化污泥掛膜反應器的10倍左右，結合處理效果對比分析可以推測，Comamonas是在異養(yǎng)硝化好氧反硝化過程中發(fā)揮關鍵作用的菌屬。
e)強化污泥掛膜生物轉(zhuǎn)盤上附著一層較厚的網(wǎng)狀結構生物膜，HN-AD菌少;菌劑掛膜生物轉(zhuǎn)盤上附著的生物膜雖然更薄，但傳質(zhì)速率更高，HN-AD菌富集程度更好，處理效果也更好。(來源:重慶理工大學化學化工學院，重慶川儀環(huán)境科技有限公司)
