1 前言(Introduction)
生物固氮是指固氮生物利用體內的固氮酶將N2催化還原成NH3(Howarth et al.，1988a)的過程.它是海洋和湖泊等生態系統初級生產力的限制性因素，影響著C和N的生物地球循環.固氮作用不僅出現在貧營養的土壤、海洋、湖泊、河口和河流等生態系統中;還出現在氮營養充足甚至富營養的海洋和湖泊等水環境中.
固氮速率的測定方法主要有總氮變量法、15N同位素法、乙炔還原法(Beversdorf et al., 2013;Glass et al., 2010)等.這些方法在不同的環境介質(土壤、水環境、生物等)的固氮速率中均被不同程度的廣泛使用，并反映出不同的優缺點.總氮變量法是直接測定系統N變量的方法，其操作和計算簡單，但測量誤差大、靈敏度低、準確度差、實驗時間長;15N同位素法是測定固N量較靈敏方法，靈敏度比總氮變量法高40~100倍左右，且直接采用15N標記的氮氣(或溶解態氮氣)作為固氮過程底物，具有較高的可靠性，但其實驗時間較長、操作繁冗且須配備同位素和質譜儀等，測定費用高，更重要的是，由于15N2在水體中需要較長時間的溶解平衡，如果測定過程時間較短，往往由于平衡不夠充分而導致固氮速率的低估.乙炔還原法(Acetylene Reduction Technique，簡稱ART)(Hardy et al., 1968;Stewart et al., 1967)是一種較經典的測定方法，通過測定固氮生物體中的固氮酶催化C2H2還原成C2H4(Dilworth，1966;Rusness and Burris， 1970)的量來計算固氮生物催化N2還原成NH3量的一種間接測定固氮速率方法，其計算需要乙炔還原與氮氣還原的當量系數，并通過當量系數轉換成固氮速率.該方法具有試驗操作簡單、方便、耗費少，高準確度和精度，靈敏度比15N同位素法高103~104倍(Hardy et al., 1973)，且其產物C2H4穩定，便于儲存，因而至今仍被廣泛用于各種水體、生物膜、沉積物等水環境固氮作用的研究中.
太湖富營養化問題長期受到關注，其根本原因是湖泊水體中N、P等營養物的過量輸入.湖泊中N的外部來源主要包括河流輸入、面源輸入、大氣沉降和生物固氮等.前3種來源已有大量的的監測和研究;但太湖水體生物固氮來源的研究和報道目前仍十分匱乏.McCarthy等(2003)在湖心區沉積物-水界面通量的研究中發現了水體向沉積物遷移的氮氣通量，推測該區域可能發生固氮作用，但仍缺乏直接證據.已有許多湖泊的固氮研究表明，生物固氮是部分湖泊富營養化過程中的重要氮源.水體的固氮作用，不僅會影響湖泊的氮收支平衡及污染物容量，還能對水體污染防治措施的有效性產生影響.
太湖，位于長江中下游平原，是一個典型的大型淺水富營養化湖泊，水域面積2338 km2，平均水深2 m，是我國第三大淺水湖泊(張路等，2004).太湖富營養化機理和控制策略等迄今已有較多研究(崔廣柏等，2009;秦伯強等，2011)，但關于富營養化問題解決方法中營養鹽控制策略的有效性研究成果甚少.
本文擬通過原位模擬試驗方法對太湖水體的固氮作用進行研究，探索太湖水體的固氮作用的存在及其時空變化特征，為太湖氮平衡的構建和完善、營養鹽總量控制和削減提供科學依據.
2 材料和方法
2.1 樣品的采集和處理
自2011年5月到2012年2月，選擇全湖33個樣點(圖 1)按季度(2011年5月(春季)、2011年8月(夏季)、2011年11月(秋季)、2012年2月(冬季))進行固氮速率的測定.采樣時用GPS進行定位，現場用便攜式多參數水質分析儀(YSI)測定并記錄常規水質參數、風速風向儀測定現場風數據.用5 L有機玻璃采水器采集0.6 m深度內的混合水樣，根據水體中藍藻生物量的多寡對水樣進行不同程度的預濃縮處理(25#浮游生物網(200目))，將原水樣和濃縮液保存于聚乙烯塑料瓶中.采樣當日15點前完成采樣和水樣固氮速率的測定.
圖1 太湖樣點圖
2.2 研究方法
2.2.1 水體固氮作用測定
本文用ART法(Granhall and Lundgren， 1971;Stewart et al., 1967)對采集水樣進行固氮速率的測定.固氮生物體內的固氮酶既能將N2催化固定成NH3，也能催化C2H2還原成C2H4.C2H2和N2與固氮酶結合部位并不相同，兩者是固氮酶催化反應的非競爭性底物(Hwang et al., 1973)，因此用ART不但能準確測定固氮速率，而且測定結果不受試驗環境中N2的影響.操作過程簡述如下：
取一定量濃縮(或原水)樣于培養瓶中，保持瓶內水體和頂空的體積比為5：1，合上膠塞，用注射器注入一定體積C2H2氣體(10%，V/V)，保持培養瓶內的C2H2分壓為10132.5 Pa(Granhall and Lundgren， 1971;Hardy et al., 1973)，在氣體注入口涂上硅橡膠防止漏氣.搖勻后將培養瓶懸掛放置在太湖湖泊生態系統研究站棧橋，控制水深為30 cm左右，以保持與樣點基本一致的溫度、光照和風浪擾動等.培養時間為2 h(Beversdorf et al., 2013;Stewart et al., 1967)，每個樣設3個平行.培養結束后，向培養瓶中抽取一定體積頂空氣體樣品轉移預先抽過真空的玻璃瓶中室溫保存，用氣相色譜儀(GC5970II，填充柱：Porapak N;FID檢測器)對氣體樣品進行檢測分析。
2.2.2 固氮速率計算
固氮酶催化N2和C2H2還原的方程式可以表述為：
在提供產出1 mol NH3所需電子數的情況下，固氮酶會催化產出1.5 mol C2H4，則1.5是C2H4-NH3的理論當量轉換系數.盡管該系數在不同的生態系統中會存在一定差異(1.2~2.1)(Bergersen，1970;Hardy et al., 1973;Stewart et al., 1968)，但基本保持在理論值1.5附近.事實上，多數固氮作用的研究(Brooks et al., 1971;Teal et al., 1979)也都采用1.5作為兩者的轉換系數.為了便于與不同生物固氮研究成果進行比較，本研究采用1.5作為兩者的轉換系數.
氣相色譜儀對氣體樣品的檢測采用保留時間進行定性分析，峰高進行定量分析.
固氮速率計算公式：
式中，Anf為固氮速率(ng · L-1 · h-1);P樣品、P空白為樣品、空白樣中的C2H4的量(μL);r為水樣濃縮比例;14為N摩爾質量(g · mol-1);1.5為固氮速率轉換系數;t為培養時間(h);V水為試驗水樣體積(L).
3 結果
3.1 固氮作用的空間差異
太湖水體固氮速率表現出明顯的空間差異(表 1，圖 2，圖 3).固氮速率的全年最高值出現在梅梁灣(32號點，Anf=16.60 ng · L-1 · h-1);最低值出現在貢湖灣(13號點，Anf=0).梅梁灣和竺山灣是固氮速率較高的湖區，貢湖灣、湖心區和西岸湖區的固氮速率總體較低.
表1 太湖各樣點水體固氮速率年均值
圖2 太湖不同湖區固氮速率
圖3 太湖水體固氮速率
在春季，太湖西岸湖區(0.17 ng · L-1 · h-1)的固氮速率較高，而東岸湖區(0.08 ng · L-1 · h-1)的固氮速率較低.夏季太湖水體的最高固氮速率出現在北部湖區梅梁灣(14.64 ng · L-1 · h-1);竺山灣(2.86 ng · L-1 · h-1)、湖東岸(2.21 ng · L-1 · h-1)等湖區也表現較強的固氮作用，而其他水域如湖心區、貢湖灣等的固氮作用較弱.在秋季，位于北半湖區的竺山灣(0.55 ng · L-1 · h-1)和梅梁灣(0.13 ng · L-1 · h-1)水域的固氮速率較高，其他如湖心區、東西岸區等湖區的固氮速率較低.冬季太湖水體最大固氮速率湖區為西岸區(Anf=1.03×10-4 ng · L-1 · h-1)，其他湖區的固氮速率低于檢測限或者不存在固氮作用.
3.2 固氮作用的季節變化
太湖水體的固氮速率表現出明顯的季節差異(圖 3、圖 4).固氮速率從春季開始逐漸增強，在夏季達到最高峰后經秋季緩緩減弱，在冬季降到最低值.春季時，固氮作用較弱，Anf在0~0.41 ng · L-1 · h-1之間，均值為0.10 ng · L-1 · h-1(SD=0.092 ng · L-1 · h-1);夏季時，固氮速率顯著增加并達到全年的最高值，Anf在0~66.10 ng · L-1 · h-1之間，均值為5.88 ng · L-1 · h-1(SD=12.11 ng · L-1 · h-1)，夏季的固氮速率比春、秋季高1個數量級，比冬季高5個數量值.固氮速率在秋季逐漸降低，Anf在0~1.88 ng · L-1 · h-1之間，均值為0.14 ng · L-1 · h-1(SD=0.32 ng · L-1 · h-1)，稍高于春季.太湖水體在冬季基本不存在固氮作用，多數水體固氮速率極低，Anf在0~2.26×10-4 ng · L-1 · h-1之間，均值為5.62×10-5 ng · L-1 · h-1(SD=5.68×10-5 ng · L-1 · h-1).
圖4 不同季節下太湖水體的固氮速率
4 討論
4.1 太湖固氮速率時空差異原因
水生態系統中固氮生物的生物量、營養、鹽度、光照、溫度、深度、微量元素等(Fu and Bell， 2003;Howarth et al., 1988a;Wetzel，1983)都是影響固氮作用的因素.先后有Drewes、Fogg等(Fogg，1942)發現魚腥藻(Ananbaena spp)和束絲藻(Aphanizomenon spp)等藍藻是淡水系統中的主要固氮生物(Capone and Carpenter， 1982;Gruber and Sarmiento， 1997).將太湖6個湖區4個季節的固氮速率與對應浮游生物的生物量進行相關分析時發現，湖區固氮速率與藍藻生物量存在顯著正相關關系(r=0.452，p<0.05)(Horne and Goldman， 1972).另一方面，由于同一次采樣時間內，太湖湖區水體的溫度基本相同(全湖最大溫差僅2.69 ℃)，溫度不會顯著影響不同湖區的固氮速率.因此，我們可以推測固氮生物藍藻的生物量是導致太湖水體固氮速率空間差異的主要原因.此外，不同湖區間營養鹽(Smith，1992)、風浪擾動等因素的差異也可能會在一定程度上強化固氮速率的空間差異.
從湖區固氮速率和水溫的散點圖(圖 5)可以發現：固氮速率隨水溫的增加呈現增加趨勢，相關分析得出太湖水體固氮速率與其水溫(4~32 ℃)呈極顯著正相關關系(p<0.01).溫度主要通過改變固氮微生物的新陳代謝和固氮酶的活性來影響固氮作用的強度(Wetzel，1983).一方面，溫度的適度增加能加快固氮生物的生長(Canale and Vogel， 1974)，從而加強固氮作用(McQueen and Lean， 1987);另一方面，固氮酶活性會隨著溫度的升高而增加(Robarts and Zohary， 1987)，固氮作用隨之也會增強.由于水體固氮速率和藍藻生物量之間的顯著相關關系和藍藻生物量的顯著季節性變化(夏高冬低)，盡管在我們的現場研究中得到的水體溫度與固氮速率之間的顯著相關性，也不能簡單解釋成溫度對固氮速率的決定性作用，但其仍是導致太湖固氮速率夏高冬低季節性特征的一個重要原因.
圖5 不同湖區固氮速率與水溫散點圖
4.2 太湖水體固氮作用的貢獻
不論是不同湖區，還是不同季節，太湖水體都表現出一定強度的固氮作用(表 1，圖 3)，年均Anf=1.53 ng · L-1 · h-1.以太湖水體表層0.6 m的透光層作為太湖固氮作用發生層，14 h · d-1為日固氮作用時間(Stewart et al., 1971)，則可計算出太湖水體的年固氮量為10.73 t(即4.6 mg · m-2 · a-1).與太湖其他氮源(面源、河流輸入等)相比，太湖水體的固氮量甚少，對太湖水體氮負荷的輸入貢獻也甚低.
不同水生態系統中的水體生物固氮作用存在明顯差異(表 2).太湖水體固氮速率(4.6 mg · m-2 · a-1)比部分海洋(如Pacific Ocean：2.0 mg · m-2 · a-1)高 1倍，比貧營養湖泊(如Lake Superior：0.3 mg · m-2 · a-1)高1個數量級;但遠低于富營養化湖泊(0.2~9.2 g · m-2 · a-1)(如Rietvlei dam：9.2 g · m-2 · a-1).
表2 太湖水體與其他水系統的固氮作用比較
由于固氮藻在無光條件下也能利用呼吸作用提供的能量來進行固氮作用(Horne，1979; Mullineaux et al., 1980)，而本研究選擇0.6 m透光層作為固氮作用發生層，14 h的固氮作用時間，在一定程度可能造成太湖水體固氮速率的低估.具體參見污水寶商城資料或http://www.xhxdt.com更多相關技術文檔。
4.3 水體固氮作用研究的意義
為了解決淡水湖泊的氮磷過剩導致的富營養化問題，長期以來一直有單獨控氮法(Howarth and Marino， 2006)、控磷法(Vollenweider，1976;Schindler，1977)和氮磷雙控法.從氮磷比考慮，單獨控氮(Howarth and Marino， 2006)，造成的氮限制，將可能出現適合固氮藍藻的生長從而出現以固氮藍藻水華替代非固氮藍藻水華的現象，因此，單獨控氮可能并非富營養化藍藻爆發的解決方法.許多湖泊營養鹽控制的實踐證明：許多湖泊采用單獨控磷來解決富營養化問題的方案都并不成功.因此，固氮速率的估算，不僅可以進一步加深太湖氮的輸入輸出過程，也可為富營養化湖泊治理及營養鹽的控制策略提供參考.
5 結論
1)太湖水體的固氮速率存在明顯的空間特征.梅梁灣、竺山灣等北部湖區的固氮速率明顯高于湖心區、貢湖灣等其他湖區.不同湖區水體中固氮微生物的生物量(p<0.05)是導致太湖不同湖區固氮速率差異的主要原因.
2)太湖水體固氮速率具有明顯的季節變化特征.固氮速率表現出夏季最高、春秋季次之、冬季最低的特點.溫度通過改變固氮微生物的新陳代謝和固氮酶的活性來影響水體固氮作用的強弱，水溫是導致太湖水體固氮速率季節差異的主要原因(p<0.01).
3)太湖水體存在一定的固氮作用，固氮速率為1.53 ng · L-1 · h-1，遠高于部分海洋和貧營養湖泊，但遠低于部分中、富營養湖泊.太湖年固氮量為10.73 t(4.6 mg · m-2 · a-1).
